【摘要】：目的1.了解BDNF高親和性受體TrkB與低親和性受體p75NTR于hASCs表達情況。2.明確不同濃度的BDNF對hASCs增殖及細胞周期相關基因影響。3.分析不同濃度的BDNF對hASCs ALP活性及成骨分化相關基因影響,探討B(tài)DNF在hASCs成骨分化過程中的作用。方法1.以膠原酶消化分離hASCs,貼壁培養(yǎng)并傳代純化。對hASCs進行流式細胞術檢測,誘導成脂、成骨分化,并進行染色,以對間充質干細胞特性進行鑒定。2.以免疫熒光雙染法檢測TrkB受體與p75NTR受體于hASCs表達情況。3.以含不同濃度BDNF的無血清培養(yǎng)基培育hASCs,分別于12h.24h.48h以MTT法檢測hASCs增殖能力變化,并于48h時收集細胞,real-t ime PCR檢測c-myc、ki-67表達水平。4.以含不同濃度BDNF的成骨誘導培養(yǎng)基培育hASCs,于成骨誘導14d時檢測hASCs的ALP活性變化,并于成骨誘導3d、7d、14d時收集細胞,real-time PCR檢測成骨標志基因Runx2、ALP、OCN表達水平。結果1.hASCs表達間充質干細胞表面標志,不表達造血干細胞表面標志,在體外經(jīng)誘導可向成脂、成骨方向分化。2.檢測結果發(fā)現(xiàn)hASCs表達TrkB受體,但未見明顯p75NTR受體表達。3.BDNF可促進hASCs增殖,上調c-myc、ki-67表達,具有濃度依賴性(尸0.05)。4.隨BDNF濃度增高,ALP活性呈下降趨勢,以100ng/ml組抑制效果最顯著(P0.05)。成骨7d時,ALP隨濃度增加出現(xiàn)下降趨勢；成骨14d時,Runx2、ALP、OCN均隨處理濃度增加出現(xiàn)下降,于100ng/ml組下降最顯著(P0.05)。結論采用酶消法與貼壁篩選法純化細胞可有效分離hASCs；高濃度BDNF可促進hASCs增殖但抑制其向成骨分化。
[Abstract]:Objective 1. To investigate the expression of BDNF high affinity receptor (TrkB) and low affinity receptor (p75NTR) in hASCs. 2. To determine the effects of different concentrations of BDNF on hASCs proliferation and cell cycle related genes. 3. 3. The effects of different concentrations of BDNF on hASCs ALP activity and osteogenic differentiation related genes were analyzed, and the role of BDNF in the process of hASCs osteogenic differentiation was discussed. Method 1. HASCs, adherent culture was digested by collagenase and purified by passage. The characteristics of mesenchymal stem cells (MSCs) were identified by flow cytometry (FCM), adipogenesis, osteogenic differentiation and staining. 2. The expression of TrkB receptor and p75NTR receptor in hASCs was detected by immunofluorescence double staining. HASCs, was cultured on serum-free medium containing different concentrations of BDNF. The proliferative ability of hASCs was detected by MTT method in 12h.24h.48h, and the cells were collected at 48 h. The expression of c-mycnki-67 was detected by real-t ime PCR. The changes of ALP activity of hASCs were detected on the 14th day of osteogenesis induced by hASCs, cultured in osteoblastic induction medium with different concentrations of BDNF, and the expression level of Runx2,ALP,OCN gene of osteoblast marker was detected by real-time PCR at 3 days, 7 days and 14 days after osteogenesis induction. Results 1.hASCs expressed mesenchymal stem cell surface markers, but did not express hematopoietic stem cell surface markers. The results showed that hASCs expressed TrkB receptor, but no significant expression of p75NTR receptor. 3.BDNF could promote the proliferation of hASCs and up-regulate the expression of c-myccnki-67 in a concentration-dependent manner. 4. With the increase of BDNF concentration, the activity of ALP decreased, especially in 100ng/ml group (P0.05). At 7 days of osteogenesis, ALP decreased with the increase of concentration, while at 14 days of osteogenesis, Runx2,ALP,OCN decreased with the increase of treatment concentration, which was the most significant in 100ng/ml group (P0.05). Conclusion the method of enzyme digestion and adherent screening can effectively isolate hASCs; high concentration BDNF, which can promote the proliferation of hASCs and inhibit its osteogenic differentiation.
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R622

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