【摘要】：【研究背景與目的】后縱韌帶骨化(Ossification of posterior longitudinal ligament,OPLL)是常見的脊柱疾患,指脊柱韌帶的異位骨化形成,骨化的后縱韌帶壓迫脊髓,易引起患者四肢與軀干感覺、運動及括約肌功能障礙,甚至導(dǎo)致四肢癱瘓和大小便失禁,是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病。OPLL發(fā)病具有種群特異性,文獻(xiàn)報道該疾病在東亞國家發(fā)病率較高,目前尚無單一的發(fā)病機制證據(jù),學(xué)者認(rèn)為遺傳因素在OPLL的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用,所以探尋OPLL特異性基因改變及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尤為重要。目前許多成骨相關(guān)基因被報道與OPLL的發(fā)展密切相關(guān),它們的上游調(diào)控因子似乎在OPLL的特異性調(diào)節(jié)機制中起重要作用。而micro RNA(miRNA)是值得探索的一個因素。文獻(xiàn)報道m(xù)iRNA不但可以調(diào)控多種基因的表達(dá),甚至可以改變細(xì)胞的狀態(tài),其作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式,參與了人類近1/3的基因表達(dá)過程,在生長發(fā)育、免疫應(yīng)答、腫瘤發(fā)生等方面具有廣泛的作用。miRNA具有非常復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),研究發(fā)現(xiàn)多種疾病中均存在miRNA的差異表達(dá)。為了破譯OPLL的上游調(diào)控網(wǎng)絡(luò),我們擬利用高通量測序和生物信息學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢,對后縱韌帶骨化韌帶細(xì)胞和正常后縱韌帶細(xì)胞差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行分析,進(jìn)一步挖掘其在后縱韌帶細(xì)胞成骨分化中的功能,明確差異表達(dá)miRNA對后縱韌帶細(xì)胞成骨分化的影響。已有很多文獻(xiàn)報道m(xù)iRNA可以調(diào)節(jié)許多細(xì)胞的成骨分化的進(jìn)程,而且這些成骨過程受miRNA精確調(diào)控,這使miRNA調(diào)節(jié)成為骨形成過程的上游關(guān)鍵因子。因此,OPLL患者中差異表達(dá)的miRNA影響下游的某些骨化相關(guān)因子的激活或抑制,韌帶骨化的進(jìn)程中也同樣受到了影響。隨之而來的問題是,上述差異表達(dá)miRNA對后縱韌帶細(xì)胞的促進(jìn)/抑制成骨作用是通過哪些中間的信號通路導(dǎo)致的呢?帶著這些疑問,我們設(shè)計了如下細(xì)胞實驗及動物試驗,以期在體外及體內(nèi)環(huán)境探究OPLL發(fā)生發(fā)展的上游調(diào)控因子及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò),為OPLL的診治提供理論依據(jù)。第一部分:高通量測序篩選后縱韌帶骨化韌帶細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNAs方法:(1)后縱韌帶細(xì)胞體外培養(yǎng);(2)樣本總RNA抽提及分離;(3)小RNA文庫的構(gòu)建及高通量測序;(4)miRNA差異表達(dá)分析;(5)GO和KEGG顯著性富集分析;(6)差異表達(dá)miRNA的驗證。結(jié)果:(1)術(shù)中所取標(biāo)本培養(yǎng)2周左右,組織塊周圍有細(xì)胞萌出,細(xì)胞呈長梭形,較瘦小,排列緊密;(2)原始序列經(jīng)過處理后,2組樣本所獲得的可用于分析的小RNA序列數(shù)量分別為2066542和1833901條。序列長度主要集中在18~22nt,說明獲得的序列質(zhì)量較高;(3)測序結(jié)果差異大于2倍的miRNAs有218個,包括144種上調(diào)的miRNAs和74種下調(diào)的miRNAs,差異大于4倍的miRNAs有154個,差異大于8倍的miRNAs有52個;(4)我們應(yīng)用GO分析,共65個顯著性(P0.01)GO術(shù)語與上調(diào)基因相關(guān),發(fā)現(xiàn)OPLLCs比PLLCs表達(dá)更多的骨化相關(guān)基因;(5)real-time PCR驗證差異表達(dá)的miRNAs與高通量測序結(jié)果基本一致。結(jié)論:我們使用下一代測序技術(shù)(NGS)來評估m(xù)iRNA和m RNA中的表達(dá)變化。發(fā)現(xiàn)了以miR-10a-3p為代表的大量差異表達(dá)的miRNAs,real-time PCR的結(jié)果也證實了與高通量測序結(jié)果一致的miRNA表達(dá)變化,這些差異表達(dá)的miRNA可能參與OPLL的發(fā)生和進(jìn)展,并為OPLL診斷或治療提供了新的靶標(biāo)。第二部分:miR-10a-3p對后縱韌帶細(xì)胞的促成骨作用方法:(1)利用轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行后縱韌帶細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)染,并對后縱韌帶細(xì)胞誘導(dǎo)成骨分化;(2)堿性磷酸酶染色方法和茜素紅染色方法對后縱韌帶細(xì)胞進(jìn)行成骨能力檢測;(3)利用western blot對待測樣品中目的蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。結(jié)果:(1)過表達(dá)miR-10a-3p促進(jìn)PLLCs成骨分化;(2)抑制miR-10a-3p后抑制OPLLCs成骨分化。結(jié)論:過表達(dá)miR-10a-3p后能夠提高PLLCs的骨化誘導(dǎo)水平,增強后縱韌帶細(xì)胞堿性磷酸酶的活性及鈣質(zhì)的沉積,而抑制miR-10a-3p后,其相應(yīng)成骨分化進(jìn)程受到抑制,說明miR-10a-3p在后縱韌帶細(xì)胞的成骨分化過程中起到了重要作用,其在OPLL患者中高表達(dá)可能發(fā)揮了其促進(jìn)韌帶骨化的作用。第三部分:miR-10a-3p促進(jìn)后縱韌帶細(xì)胞成骨分化的機制研究方法:(1)采用Targetscan 6.0并利用GO和KEGG功能顯著性富集分析miR-10a-3p的潛在靶基因;(2)螢光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C靶基因;(3)Ch IP分析miR-10a-3p靶基因下游通路。結(jié)果:(1)預(yù)測miR-10a-3p的靶基因為ID3和HAND2;(2)PLLCs中過表達(dá)miR-10a-3p可在一定程度上降低ID3的表達(dá),在OPLLCs中抑制miR-10a-3p,可以顯著增加ID3的表達(dá);(3)Ch IP分析miR-10a-3p過表達(dá)后,RUNX2與OCN和ALP的結(jié)合在PLLCs中顯著增加,而在OPLLCs中抑制miR-10a-3p后,RUNX2與OCN和ALP的結(jié)合顯著降低。結(jié)論:通過預(yù)測miR-10a-3p的靶基因并進(jìn)行驗證,我們最終發(fā)現(xiàn)其可能靶基因為ID3,Ch IP分析結(jié)果顯示miR-10a-3p可通過靶向ID3主動調(diào)節(jié)韌帶細(xì)胞的骨化水平,從而促進(jìn)RUNX2與骨化相關(guān)基因結(jié)合,促進(jìn)OPLL的發(fā)生發(fā)展,在體外驗證了PLL和OPLL韌帶細(xì)胞中miR-10a-3p發(fā)揮作用的功能和機制。第四部分:在體研究miR-10a-3p促進(jìn)后縱韌帶骨化方法:(1)將過表達(dá)miR-10a-3p的穩(wěn)定細(xì)胞株和骨膠原支架共孵育,并進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化;(2)使用micro-CT進(jìn)行樣本分析,計算骨礦物質(zhì)密度(BMD,mg/cc)和新骨體積與現(xiàn)有組織體積的比例(BV/TV);(3)HE染色和免疫組化分析驗證體外實驗結(jié)果。結(jié)果:(1)OPLL韌帶細(xì)胞在體內(nèi)具有很強的成骨能力;(2)miR-10a-3p在體內(nèi)具有促進(jìn)后縱韌帶細(xì)胞成骨的作用;(3)HE染色顯示,在OPLL細(xì)胞處理組(抑制miR-10a-3p)中形成了比其他細(xì)胞類型組更大的骨細(xì)胞缺陷范圍和更有組織的細(xì)胞外基質(zhì)層狀骨。PLL組中過表達(dá)miR-10a-3p導(dǎo)致更大的層狀骨形成,而OPLL組中抑制miR-10a-3p導(dǎo)致骨形成減少,OCN處理的免疫組化結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-10a-3p導(dǎo)致更多的陽性染色細(xì)胞,而抑制miR-10a-3p導(dǎo)致陽性染色細(xì)胞減少。然而,ID3在抑制miR-10a-3p后顯示更多的陽性染色細(xì)胞,而過表達(dá)miR-10a-3p后顯示較少。結(jié)論:miR-10a-3p不僅在簡單的體外環(huán)境對后縱韌韌帶細(xì)胞的成骨分化具有重要作用,在復(fù)雜的生物活體條件下,miR-10a-3p對ID3的負(fù)向調(diào)控作用也得到了證實。小結(jié)隨著高通量技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,近年來大大擴展和鑒定了miRNA的存在,本課題通過高通量測序技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)分析方法,找出了后縱韌帶骨化中差異表達(dá)的miRNA和可能的靶基因。在我們的研究中,我們結(jié)合韌帶細(xì)胞的體外成骨分化誘導(dǎo)以和體內(nèi)骨形成測定,發(fā)現(xiàn)miR-10a-3p在后韌帶細(xì)胞的成骨分化中起重要作用,并表明miR-10a-3p的靶基因ID3在PLL和OPLL之間表達(dá)存在明顯差異,使其和miR-10a-3p成為可能的配對功能組合,在OPLL的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮積極作用。我們通過在PLLCs中過表達(dá)miR-10a-3p并在OPLLCs中抑制其表達(dá),結(jié)果顯示miR-10a-3p可通過靶向ID3主動調(diào)節(jié)韌帶細(xì)胞的骨化水平,從而促進(jìn)RUNX2與骨化相關(guān)基因的結(jié)合。體內(nèi)試驗也得出了同樣的結(jié)論,我們確定了OPLL發(fā)生發(fā)展的上游調(diào)節(jié)因子,認(rèn)為miR-10a-3p通過ID3/RUNX2軸發(fā)揮其功能,并且首次揭示miR-10a-3p/ID3/RUNX2軸在OPLL中的重要作用。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R681.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2296178