【摘要】：第一部分內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)導(dǎo)致豚鼠繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎模型的觀察目的:探討豚鼠內(nèi)側(cè)半月板切除(medial menisectomy,MNX)后關(guān)節(jié)炎的發(fā)生特點(diǎn)、軟骨組織病理變化,來評價(jià)骨性關(guān)節(jié)模型的建立是否成功,為后期實(shí)驗(yàn)提供正確的使用模型。方法:1 3月齡雄性DH豚鼠24只,隨機(jī)將動物分為2組(n=12):Sham組和MNX組,分別行假手術(shù)和內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)。2所有動物術(shù)后飼養(yǎng)12周處死,利用OARSI關(guān)節(jié)評分系統(tǒng)對關(guān)節(jié)退變情況進(jìn)行評估,利用免疫組化技術(shù)對軟骨組織中OA相關(guān)因子表達(dá)水平進(jìn)行分析,利用Micro-CT技術(shù)對脛骨平臺側(cè)的軟骨下骨進(jìn)行掃描記錄,分析內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)對軟骨下骨的作用。結(jié)果:1兩組動物體重隨時(shí)間逐漸增長,各時(shí)間點(diǎn)兩組間體重?zé)o顯著差異;2 OARSI大體評分結(jié)果顯示,MNX組評分高于Sham組(MNX組vs.Sham組,2.92±0.20 vs.0.83±0.52,P0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;3 MNX組動物術(shù)后關(guān)節(jié)退變嚴(yán)重,OARSI組織學(xué)評分顯示MNX組總分及CS、PG、CL和OST子項(xiàng)評分均顯著高于Sham組(P0.05);4與Sham組相比,MNX動物的脛骨平臺軟骨負(fù)重區(qū)AGG表達(dá)水平顯著下降(P0.001),ADAMTS4(P0.05)、Caspase3(P0.001)和MMP13(P0.05)的表達(dá)水平則顯著增高。此外,AGG/ADAMTS4比值(P0.05)和Col-II/MMP13比值(P0.05)顯著下降,而Col-II/AGG比值顯著升高(P0.05)。5 Micro-CT檢測結(jié)果:MNX組可見關(guān)節(jié)邊緣內(nèi)側(cè)緣性骨組織增生明顯,脛骨上端下骨小梁顯著減少。與Sham組相比,MNX組動物脛骨平臺軟骨下骨BMD顯著降低(P0.05),BV/TV、Tb.Th顯著降低(P0.05),Tb.Sp和SMI顯著增加(P0.05)。第二部分雷奈酸鍶對內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)誘導(dǎo)豚鼠關(guān)節(jié)炎的作用目的:Dunkin-Hartley(DH)豚鼠內(nèi)側(cè)半月板切除(MNX)導(dǎo)致繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)模型后,早期應(yīng)用雷奈酸鍶(strontium ranelate,SR),探討SR對MNX豚鼠關(guān)節(jié)炎的作用。方法:1 3月齡DH雄性豚鼠36只,隨機(jī)分為三組,每組各12只:MNX+NS組、MNX+CLX組和MNX+SR組,每組再隨機(jī)分成2個亞組(n=6),一亞組用于大體觀察,另一亞組用于組織學(xué)觀察,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后對各組進(jìn)行右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)。2術(shù)后一周開始給藥,MNX+SR組給予SR 625mg/kg/d灌胃,MNX+CLX組給予CLX 20mg/kg/day灌胃,MNX+NS組給予等量生理鹽水灌胃。3給藥12周后,處死動物并解剖右膝關(guān)節(jié)。通過肉眼觀察脛骨平臺和股骨髁的顏色、平滑度、滑液性狀和關(guān)節(jié)表面磨損情況。應(yīng)用OARSI進(jìn)行關(guān)節(jié)大體評分。制備標(biāo)本切片,進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色,依據(jù)OARSI組織學(xué)評分系統(tǒng)對內(nèi)側(cè)脛骨平臺損傷情況及骨贅情況進(jìn)行評分。結(jié)果:1 DH豚鼠隨著年齡的增長體重也逐漸增加。12周時(shí)MNX+NS組、CLX組和MNX+SR組體重?zé)o顯著差異,說明SR給藥對豚鼠的生長和發(fā)育沒有顯著影響,不影響體重。2軟骨的OARSI大體評分:造模術(shù)后內(nèi)側(cè)脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)了明顯的磨損,脛骨內(nèi)側(cè)平臺軟骨表面變得粗糙,在軟骨的內(nèi)側(cè)邊緣形成裂隙并有軟骨增生。給予CLX或SR的豚鼠術(shù)側(cè)OARSI大體評分均值較MNX+NS組略有降低,但均未見顯著差異。3軟骨組織學(xué)觀察結(jié)果:各組軟骨均發(fā)生嚴(yán)重退變,負(fù)重區(qū)軟骨嚴(yán)重受損,表現(xiàn)為軟骨缺失、甲苯胺藍(lán)染色減弱、形成細(xì)胞集群、潮線連續(xù)中斷、關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)邊緣有骨贅形成。OARSI組織學(xué)評分結(jié)果顯示:MNX+CLX組的總評分均顯著低于MNX+NS組(MNX+CLX組vs.MNX+NS組,10.78±1.91vs.17.36±1.92,P0.05),而MNX+SR組總評分與MNX+NS組相比未見顯著差異。軟骨厚度測量結(jié)果顯示,MNX+CLX組動物軟骨厚度顯著高于MNX+NS組(MNX+CLX組vs.MNX+NS組,360.19±38.93μmvs.264.73±58.01μm,P0.05),而MNX+SR組軟骨厚度與MNX+NS組相比未見顯著差異。此外,MNX+SR組骨贅高度顯著高于MNX+NS組(MNX+SR組vs.MNX+NS組,198.18±48.31μmvs.106.86±57.11,P0.05),MNX+CLX組骨贅高度略小于MNX+NS組,但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4骨贅?biāo)莸挠^察:大體觀察SR組中有5個樣品有塌陷骨贅的表現(xiàn),而MNX組僅有1個樣本表現(xiàn)相同的外觀,CLX組未見類似現(xiàn)象,這種變化在三組之間無顯著差異。組織學(xué)觀察SR組有2個樣本發(fā)生塌陷,結(jié)合大體和組織學(xué)觀察,SR組發(fā)生骨贅?biāo)莸臉?biāo)本為7個,而MNX組僅有1個,兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第三部分雷奈酸鍶對內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)誘導(dǎo)豚鼠關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制探討目的:通過我們前部分的實(shí)驗(yàn)觀察,SR并未能起到對關(guān)節(jié)炎的滿意效果,發(fā)現(xiàn)其(625mg/kg/day)未能阻止MNX豚鼠軟骨的退變,甚至SR的攝入導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎骨贅的增生,甚至塌陷。因此,在本實(shí)驗(yàn)通過對SR治療作用后的關(guān)節(jié)炎軟骨及軟骨下骨的進(jìn)一步研究,來探討產(chǎn)生這種現(xiàn)象的機(jī)制。方法:1 3月齡DH雄性豚鼠36只,隨機(jī)分為三組,每組各12只:MNX+NS組、MNX+CLX組和MNX+SR組,每組再隨機(jī)分成2個亞組(n=6),一亞組用于Micro-CT檢測,另一亞組用于免疫組化檢測,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后對各組進(jìn)行右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)。2術(shù)后一周開始MNX+SR組給予SR 625mg/kg/day灌胃,MNX+CLX組給予CLX 20mg/kg/day灌胃,MNX+NS組給予等量生理鹽水灌胃。3給藥12周后處死動物,解剖右膝關(guān)節(jié),Micro-CT掃描檢測脛骨平臺軟骨下骨,測定骨礦物質(zhì)密度(BMD)、骨微結(jié)構(gòu)指數(shù)(BV/TV),骨小梁厚度(Tb.Th),骨小梁數(shù)量(Tb.N),骨小梁分離度(Th.Sp)和結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)模型指數(shù)SMI),各向異性程度(DA)來分析給予CLX和SR對內(nèi)側(cè)半月板切除后軟骨下骨的影響。制備標(biāo)本切片后,進(jìn)行免疫組化檢測,一抗分別為為:AGG(1:200),ADAMTS-4(1:200),Caspase-3(1:200),Col-II(1:50),和MMP-13(1:200)。結(jié)果:1免疫組化結(jié)果:三組間AGG、Col-II、Caspase3和MMP13在內(nèi)側(cè)脛骨平臺負(fù)重區(qū)的表達(dá)結(jié)果未見顯著差異,而MNX+CLX組的ADAMTS4在術(shù)側(cè)內(nèi)側(cè)脛骨平臺負(fù)重區(qū)的表達(dá)水平顯著低于MNX+NS組(MNX+CLX組vs.MNX+NS組,5243.96±2507.38 vs.11153.19±1958.72,P0.05)。此外,內(nèi)側(cè)脛骨平臺負(fù)重區(qū)AGG/ADAMTS4表達(dá)水平的比值在MNX+CLX組顯著高于MNX+NS組(MNX+CLX組vs.MNX+NS組,1.28±0.63 vs.0.45±0.14,P0.05),而Col-II/MMP13和Col-II/AGG兩項(xiàng)指標(biāo)在三組間未見差異。2內(nèi)側(cè)脛骨平臺軟骨下骨形態(tài)分析:CLX對軟骨下骨未造成顯著影響,而SR則顯著增強(qiáng)MNX豚鼠內(nèi)側(cè)脛骨平臺負(fù)重區(qū)軟骨下骨BMD,并且顯著改善了BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp和SMI等形態(tài)學(xué)參數(shù)。結(jié)論:1通過切除DH豚鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板誘發(fā)關(guān)節(jié)退變,主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨丟失、骨贅形成,軟骨基質(zhì)中以及軟骨細(xì)胞表達(dá)蛋白多糖顯著減少,軟骨組織中基質(zhì)成分與基質(zhì)降解酶類比例失調(diào),軟骨細(xì)胞表達(dá)凋亡相關(guān)因子caspase-3增多,與典型的骨關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)類似。同時(shí),DH豚鼠術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)脛骨平臺負(fù)重區(qū)軟骨下骨有明顯的骨量丟失,這一表現(xiàn)符合早期骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨的表現(xiàn)。因此,DH豚鼠MNX模型是一種早期骨關(guān)節(jié)炎模型。2在SR的作用下DH豚鼠MNX模型術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)脛骨平臺負(fù)重區(qū)軟骨下骨的骨密度顯著提高,MNX導(dǎo)致的軟骨下骨形態(tài)改變被顯著抑制,但是未觀察到SR對MNX導(dǎo)致的關(guān)節(jié)退變有延緩作用,而目前臨床指南推薦用藥——塞來昔布表現(xiàn)出對關(guān)節(jié)退變有一定程度延緩作用。3雷奈酸鍶(625mg/kg/day)未能阻止MNX豚鼠軟骨的退變,這種結(jié)果產(chǎn)生的原因可能是由于SR未能抑制ADAMT4及MMP3的活性、進(jìn)而未能阻止細(xì)胞外基質(zhì)AGG降解,并且SR未能抑制軟骨細(xì)胞凋亡的發(fā)生以及軟骨下骨顯著硬化也是SR在本實(shí)驗(yàn)中未能對OA軟骨起到保護(hù)作用的原因。SR的攝入導(dǎo)致骨贅增生,甚至塌陷,這可能與鈣化骨贅吸收并促進(jìn)其增殖的能力有關(guān)。未來當(dāng)骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)行雷奈酸鍶的研究時(shí),這種不利影響應(yīng)予以重視,因?yàn)檫@可能會掩蓋它的治療效果。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R684.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 薛慶云;王坤正;裴福興;朱漢民;金大地;陶天遵;李恩;李寧華;張耀南;王曉濱;紀(jì)泉;;中國40歲以上人群原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎患病狀況調(diào)查[J];中華骨科雜志;2015年12期

2 張恩水;閆新峰;張明;呂士紅;白正武;賀業(yè)騰;袁振;;聚蛋白多糖酶和基質(zhì)金屬蛋白酶在骨關(guān)節(jié)炎不同時(shí)期關(guān)節(jié)液中的表達(dá)[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2012年07期

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本文編號：2274162