【摘要】：研究背景：異位骨化(Heterotopic Ossification, HO)是指在正常情況下沒有骨組織的軟組織內(nèi)形成的新生病理骨組織,其既不是單純的鈣鹽沉積,也不同于骨折愈合中的新骨形成。隨著人工關(guān)節(jié)置換的廣泛應(yīng)用以及交通傷導(dǎo)致的高能量創(chuàng)傷數(shù)量增加,異位骨化發(fā)病率也顯著上升,研究表明在沒有進(jìn)行預(yù)防性治療的情況下,異位骨化發(fā)生率高達(dá)60%-75%,髖臼骨折切開復(fù)位內(nèi)固定術(shù)發(fā)生率超過60%,脊髓損傷后的發(fā)生率為20%-25%,其中約18%-35%出現(xiàn)明顯的關(guān)節(jié)活動受限,閉合性顱腦損傷后異位骨化的發(fā)生率為10%-20%,其中約10%產(chǎn)生明顯的關(guān)節(jié)活動受限。HO的發(fā)病主要可分為三個階段：(1)炎性浸潤及間充質(zhì)干細(xì)胞分化階段,(2)軟骨細(xì)胞,成骨細(xì)胞等生長階段,(3)病理骨組織成熟階段。早期HO局部有明顯腫痛,關(guān)節(jié)活動受限。晚期由于骨組織形成,導(dǎo)致關(guān)節(jié)活動限制。其基本病理改變是在纖維結(jié)締組織中,原始細(xì)胞增殖活躍伴有豐富的毛細(xì)血管網(wǎng),鈣鹽沉積,形成骨。成熟的異位骨化具有骨的結(jié)構(gòu),外層包裹纖維結(jié)締組織,里面是成骨細(xì)胞,具有小梁結(jié)構(gòu)及類骨組織,中心是活躍的原始細(xì)胞。臨床診斷主要依靠X線及CT檢查進(jìn)行診斷。治療中往往對存在高危因素患者實行預(yù)防性治療如放射治療、非甾體類抗炎藥及二磷酸鹽等,然而傳統(tǒng)非甾體類抗炎藥具有胃腸副作用,給患者帶來了傷痛,限制了其應(yīng)用,同時預(yù)防性放療會導(dǎo)致患者出現(xiàn)癌癥幾率增加,并干擾正常成骨(如骨折愈合和假體植入后的骨長入),并且治療后仍有較高的發(fā)生率。對于已經(jīng)形成的異位骨化,臨床上有效的治療方法只有手術(shù)切除,因此,對異位骨化的早期診斷可以避免對不出現(xiàn)異位骨化的患者進(jìn)行過度的預(yù)防性治療。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)家族是一類高度保守的鋅離子和鈣離子依賴的基因多態(tài)性內(nèi)切蛋白水解酶家族,由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞等以無活性的酶原形式分泌到細(xì)胞外,經(jīng)過活化后在中性條件下發(fā)揮活性。它的表達(dá)受即早基因、細(xì)胞因子、生長因子的調(diào)節(jié),同時很多細(xì)胞因子可誘導(dǎo)MMPs的表達(dá),如白介素-1、白介素-6、血小板衍化生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-B、成纖維細(xì)胞生長因子、腫瘤壞死因子-a等,起抑制作用的有干擾素B-1b。 MMPs除在轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)節(jié)外,其活性亦在酶原激活、酶活性的抑制等環(huán)節(jié)受到調(diào)控,不同MMPs之間可能也具有活化作用,MMPs的蛋白水解酶活性受非特異性和特異性抑制劑抑制,非特異性抑制劑包括a2-巨球蛋白、a1-抗胰蛋白酶、巴馬斯汀(batimastatBB-1101、BB-94)等�；|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)是一種糖化蛋白酶,參與內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和基質(zhì)角質(zhì)細(xì)胞核遷移等,在基質(zhì)降解、組織重塑、細(xì)胞遷移、血管生成、傷口愈合,骨生長等病理生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,是軟骨基質(zhì)降解中最重要的酶之一,是早期的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重組的生物標(biāo)記物。MMP-9表達(dá)細(xì)胞存在于骨髓中,在骨骼肌缺氧環(huán)境下會使MMP-9極大的增強(qiáng),同時在體外實驗顯示,間充質(zhì)干細(xì)胞增加毛細(xì)血管網(wǎng)的生長,并伴隨有MMP-2和MMP-9的升高�；|(zhì)金屬蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2, MMP-2)可表達(dá)在成骨細(xì)胞及部分破骨細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),同時可對骨基質(zhì)進(jìn)行降解,并抑制骨質(zhì)吸收和促進(jìn)骨重建修復(fù)。成骨細(xì)胞中分泌MMP-2蛋白的變化過程可反映骨代謝的基本情況,如果血清中MMP-2蛋白水平升高,骨轉(zhuǎn)換的速度也隨之增快。組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TMPs)廣泛分布于體液與組織中,其來源主要是巨噬細(xì)胞和結(jié)締組織,同時纖維細(xì)胞以及成骨細(xì)胞亦可分泌,MMPs與TIMPs之間保持相對的特異性和功能上的動態(tài)平衡。當(dāng)病理條件下,MMPS與TIMPS間的動態(tài)平衡被打破,會使細(xì)胞外基質(zhì)過度分解,出現(xiàn)相對應(yīng)的病理變化。有研究表明,TIMP-1蛋白可選擇性抑制MMP-9蛋白的功能,TIMP-2蛋白可選擇性抑制MMP-2蛋白的功能,TIMPs蛋白在細(xì)胞外基質(zhì)代謝過程中對MMP蛋白起到相應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)作用,阻止MMP的活化以及對細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用,影響蛋白分解的程度和時間。最近研究認(rèn)為MMP-9蛋白對異位骨化早期發(fā)生有預(yù)測作用,本研究通過使用腦創(chuàng)傷大鼠模型合并大鼠跟腱鉗夾誘導(dǎo)異位骨化模型,綜合比較與MMP-9蛋白同屬明膠酶的明膠酶A (MMP-2),以及其抑制劑TIMP-1的變化。通過對血液標(biāo)本使用ELISA法檢測蛋白含量,局部組織進(jìn)行HE切片、免疫組化染色以及RT-PCR基因相對表達(dá)量。分析MMP-9蛋白在異位骨化早期預(yù)測作用的特異性以及在局部組織的分泌變化關(guān)系,以此了解早期階段異位骨化局部組織中的相關(guān)蛋白變化過程,為研究異位骨化發(fā)病機(jī)制提供參考依據(jù)。第一章 MMP-9在大鼠跟腱異位骨化模型中的動態(tài)變化研究[目的]大鼠跟腱切斷HO模型是近年來運用較多的HO模型,適用于創(chuàng)傷性HO的相關(guān)研究,基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)是一種糖化蛋白酶,由間質(zhì)細(xì)胞,如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌,參與內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和基質(zhì)角質(zhì)細(xì)胞核遷移等,在基質(zhì)降解、組織重塑、細(xì)胞遷移、血管生成、傷口愈合,骨生長等病理生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過觀測創(chuàng)傷早期大鼠異位骨化模型中基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)變化,探討MMP-9對預(yù)測異位骨化發(fā)生的價值。[方法]取4-4.5周齡雄性SD大鼠132只,體重135.0±6.5g,隨機(jī)分為兩組(n=66)。實驗組通過鉗夾并切斷跟腱制備異位骨化模型,對照組僅暴露跟腱。術(shù)后觀察兩組大鼠一般情況,2、3、4、5、6、7、8 d兩組各取8只大鼠,取跟腱組織行大體、組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色觀察,取血清及跟腱組織分別行ELISA及RT-PCR檢測MMP-9蛋白含量及基因表達(dá)。通過兩組剩余10只大鼠術(shù)后5、10周X線片及術(shù)后10周組織學(xué)觀察結(jié)果,診斷異位骨化形成情況。[結(jié)果]所有大鼠均存活至實驗完成。各時間點對照組大鼠跟腱無明顯變化,呈正常跟腱結(jié)構(gòu)；實驗組隨時間延長,跟腱斷端硬度逐漸增加,出現(xiàn)大量不規(guī)則結(jié)締組織及軟骨細(xì)胞,MMP-9免疫組織化學(xué)染色呈深染陽性。各時間點實驗組MMP-9蛋白含量及基因相對表達(dá)量均顯著高于對照組(P0.05)；實驗組MMP-9蛋白含量及基因相對表達(dá)量均總體呈上升趨勢(P0.05)。根據(jù)X線片及組織學(xué)觀察結(jié)果,術(shù)后10周實驗組大鼠跟腱組織均發(fā)生異位骨化,對照組均無異位骨化發(fā)生。[結(jié)論]在大鼠跟腱異位骨化早期,MMP-9表達(dá)明顯升高,提示其對預(yù)測異位骨化發(fā)生有參考意義。第二章MMP-9,MMP-2,TIMP-1在創(chuàng)傷性異位骨化動物模型中的動態(tài)變化研究[目的]大鼠自由落體腦創(chuàng)傷模型是一種較為成熟的腦創(chuàng)傷模型,大鼠跟腱HO模型也是近年來運用較多的HO模型。我們運用這2種模型互相疊加,通過對比是否合并腦創(chuàng)傷,探討腦創(chuàng)傷對異位骨化的影響。同時對異位骨化早期MMP-9, MMP-2以及TIMP-1的蛋白變化曲線進(jìn)行研究分析,探討MMP-9, MMP-2, TIMP-1在異位骨化早期的作用機(jī)制以及與異位骨化發(fā)生的關(guān)系。[方法]取4-4.5周齡雄性SD大鼠264只,體重135.0±6.5g,隨機(jī)分為四組(n=66)。分別為腦創(chuàng)傷合并跟腱鉗夾切斷組(A組),腦創(chuàng)傷合并創(chuàng)傷對照組(B組),跟腱鉗夾切斷組(C組),創(chuàng)傷對照組(D組)。術(shù)后1、2、3、4、5、6、7天,分別從4組大鼠隨機(jī)取8只大鼠進(jìn)行解剖及標(biāo)本收集、分析。4組大鼠各留10只于術(shù)后5、10周觀測動物模型的制備效果。取跟腱組織行大體、組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色觀察,取血清及跟腱組織分別行ELISA及RT-PCR檢測MMP-9, MMP-2,TIMP-1蛋白含量及基因表達(dá)。通過兩組剩余10只大鼠術(shù)后5、10周X線片及術(shù)后10周組織學(xué)觀察結(jié)果,診斷異位骨化形成情況。[結(jié)果]所有大鼠均存活至實驗完成。A組與B組大鼠出現(xiàn)行動遲緩,進(jìn)食減少,體重下降等癥狀。四組大鼠術(shù)后均出現(xiàn)右下肢活動減少,2-3周后恢復(fù)正常。A組大鼠術(shù)后5周X線片觀察,出現(xiàn)高亮陰影100%(10/10),術(shù)后10周出現(xiàn)高亮陰影100%(10/10)。B組大鼠術(shù)后5周,出現(xiàn)高亮陰影40%(4/10),術(shù)后10周出現(xiàn)高亮陰影80%(8/10)。C組大鼠術(shù)后5周X線片觀察,出現(xiàn)高亮陰影80%(8/10),術(shù)后10周出現(xiàn)高亮陰影100%(10/10)。D組大鼠術(shù)后5周X線片觀察,出現(xiàn)高亮陰影0%(0/10),術(shù)后10周出現(xiàn)高亮陰影0%(0/10)。四組動物模型血清MMP-9, MMP-2, TIMP-1蛋白含量及其基因相對表達(dá)量均出現(xiàn)升高(P0.05)。A,B,C組大鼠血清MMP-9蛋白含量均高于D組大鼠(P0.05),A組與C組大鼠術(shù)后5-7天MMP-9蛋白含量均高于B組大鼠(P0.05)。實驗中A、B、C組大鼠MMP-2基因表達(dá)量均高于D組(P0.05)。 A、B、C組大鼠TIMP-1蛋白均較D組大鼠升高(P0.05)。A、C兩組進(jìn)行跟腱鉗夾的大鼠,TIMP-1基因相對表達(dá)量明顯較B、D兩組升高(P0.05)。從術(shù)后5天起,各組大鼠MMP-9敏感曲線面積達(dá)到1.0(P=0.001),D組大鼠MMP-9蛋白與TIMP-1蛋白呈正相關(guān)(P0.05),A、B、C組大鼠均不具有相關(guān)關(guān)系。[結(jié)論]1.腦創(chuàng)傷會導(dǎo)致大鼠MMP-9與MMP-2在術(shù)后早期出現(xiàn)升高；2.腦創(chuàng)傷能使未達(dá)到異位骨化發(fā)生程度的創(chuàng)傷部位發(fā)生異位骨化的病理變化,提高異位骨化的發(fā)病率及異位骨化的嚴(yán)重程度：3. MMP-9, MMP-2, TIMP-1這三種蛋白在異位骨化發(fā)病過程及創(chuàng)傷修復(fù)過程中均起重要作用；4.血清中MMP-9蛋白含量可能與異位骨化的嚴(yán)重程度呈正比,且具有早期預(yù)測異位骨化發(fā)生的意義；5.血清中MMP-9蛋白含量在術(shù)后5-7天診斷異位骨化的敏感性最高；6. TIMP-1蛋白主要與局部組織損傷程度相關(guān),在局部組織主要起保護(hù)作用；7.異位骨化的產(chǎn)生與MMP-9與TIMP-1蛋白的平衡失調(diào)相關(guān),MMP-9與TIMP-1的表達(dá)失調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)出現(xiàn)病理性降解過度。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R681

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2257122