【摘要】：目的 :觀察缺氧和營養(yǎng)缺乏對軟骨終板干細胞(cartilage endplate-derived stem cells,CESCs)凋亡的影響,探討B(tài)細胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B 19-k Da結合蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-k Da-interacting protein 3,BNIP3)信號通路在其中的作用。方法 :從臨床獲取退變椎間盤軟骨終板標本,分離培養(yǎng)軟骨終板細胞,使用瓊脂糖篩選獲得CESCs并進行干細胞標志物鑒定,將第三代細胞分別在常氧/完全培養(yǎng)基(對照組)與缺氧和營養(yǎng)缺乏(實驗組)條件下培養(yǎng)48h,通過流式細胞術檢測細胞凋亡率,CCK-8法檢測細胞活性,Western Blot檢測BNIP3、Bcl-2關聯(lián)x蛋白(Bax)、Bcl-2關聯(lián)k蛋白(Bak)和低氧誘導因子1α(HIF-1α)蛋白表達水平。使用BNIP3小干擾RNA(siRNA)干擾CESCs中BNIP3基因,同時設置陰性干擾對照組(Scramble siRNA),同前分組處理后再次檢測細胞凋亡率、細胞活性及BNIP3、Bax、Bak蛋白的表達水平。結果:對5例標本獲得的CESCs進行了干細胞標志物鑒定,其中細胞表面粘附分子44(CD44)、CD73、CD90和CD105為陽性,CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR為陰性,提示CESCs具有干細胞特性。實驗組細胞凋亡率為(29.12±0.65)%顯著高于對照組的(14.87±2.03)%(P0.05);實驗組的細胞增殖活性明顯降低,為對照組的56.18%(P0.05)。與對照組相比,實驗組BNIP3、Bax、Bak蛋白的表達均顯著上調(P0.05)。使用BNIP3 siRNA干擾后,缺氧和營養(yǎng)缺乏引起的細胞凋亡增加和細胞增殖活力下降均被明顯抑制;同時,缺氧和營養(yǎng)缺乏導致CESCs中BNIP3、Bax和Bak的蛋白表達升高也被顯著逆轉(P0.05)。結論:缺氧和營養(yǎng)缺乏能夠誘導CESCs發(fā)生凋亡,此過程可能是通過上調BNIP3、Bax和Bak蛋白表達而發(fā)揮作用的。
[Abstract]:Aim: to investigate the effects of hypoxia and nutritional deficiency on apoptosis of cartilage endplate-derived stem cells in vitro, and to investigate the role of Bcl-2/adenovirus E1B 19-k Da-interacting protein 3 (BNIP3) signaling pathway in B-cell lymphoma / leukemia / adenovirus E1B 19-k Da binding protein 3 (Bcl-2/adenovirus E1B 19-k Da-interacting protein 3). Methods: the specimens of degenerative intervertebral disc cartilage endplate were obtained from clinic, the chondrocytes were isolated and cultured, CESCs was obtained by agarose screening, and stem cell markers were identified. The third generation cells were cultured in normoxic / complete medium (control group) and hypoxia and nutrition deficiency (experimental group) for 48h respectively. The apoptosis rate was detected by flow cytometry and the cell activity was detected by CCK-8 method. Western Blot was used to detect BNIP3Bcl 2 association. The expression levels of (Bak) and HIF-1 偽 protein associated with Bcl-2 in x protein (Bax) were detected. BNIP3 small interference RNA (siRNA) was used to interfere BNIP3 gene in CESCs, and the negative interference control group (Scramble siRNA),) was used to detect the apoptosis rate, cell activity and the expression level of BNIP3 Bax-Bak protein. Results: stem cell markers were identified in 5 cases of CESCs. The results showed that the cell surface adhesion molecule 44 (CD44) CD73 CD90 and CD105 were positive for CD34, CD45, CD11, CD19 and HLA-DR, indicating that CESCs had stem cell characteristics. The apoptosis rate of experimental group (29.12 鹵0.65)% was significantly higher than that of control group (14.87 鹵2.03)% (P0.05), and the proliferative activity of experimental group was significantly lower than that of control group (56.18%, P0.05). Compared with the control group, the expression of BNIP3 was significantly up-regulated in the experimental group (P0.05). The increase of apoptosis and the decrease of cell proliferation activity induced by hypoxia and nutrition deficiency were significantly inhibited after BNIP3 siRNA interference, and the increase of protein expression of BNIP3, Bax and Bak in CESCs was also significantly reversed by hypoxia and nutritional deficiency (P0.05). Conclusion: hypoxia and nutritional deficiency can induce apoptosis of CESCs, which may be mediated by up-regulating the expression of BNIP3, Bax and Bak proteins.
【作者單位】： 第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院骨科;
【基金】：國家自然科學基金資助項目(編號:81272028)
【分類號】：R681.5

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本文編號：2178033