【摘要】：PHB2(Prohibitin2,37KD)是進(jìn)化上高度保守的多功能蛋白,廣泛分布于細(xì)菌、酵母、原蟲、植物、果蠅以及哺乳類等多種生物細(xì)胞中,參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移、凋亡及線粒體形態(tài)發(fā)生等生理過程,以及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄、和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而,對PHB2的研究仍處于初級階段,很多功能及機(jī)制仍不清晰。橫紋肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma)是源于向橫紋肌分化的原始間葉細(xì)胞,并由不同分化程度的橫紋肌細(xì)胞組成的軟組織惡性腫瘤。臨床表現(xiàn)的多樣性、病理改變的多重性以及發(fā)病部位的多變性,使橫紋肌肉瘤成為最復(fù)雜的小兒腫瘤之一。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)PHB2能抑制骨骼肌的分化,而橫紋肌肉瘤正是以骨骼肌祖細(xì)胞過度增殖及分化缺陷為主要特征,這些證據(jù)提示PHB2與橫紋肌肉瘤形成可能具有一定的相關(guān)性。故本文采用RNA干涉技術(shù),使RD細(xì)胞系(Rhabdomyosarcoma cells)中的PHB2表達(dá)沉默,觀察PHB2表達(dá)沉默對RD細(xì)胞增殖、分化、遷移等方面的影響并對相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行初步探究,為進(jìn)一步探究PHB2在橫紋肌肉瘤發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)作用提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容如下:1、通過實時阻抗細(xì)胞分析技術(shù)檢測到PHB2表達(dá)沉默后,RD細(xì)胞活力降低。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示,PHB2表達(dá)沉默后細(xì)胞G1期的比例增加,細(xì)胞被阻滯在G1/S期,從而抑制了 RD細(xì)胞的增殖;2、軟瓊脂中克隆形成實驗顯示PHB2表達(dá)沉默后,RD細(xì)胞的錨定非依賴性克隆形成能力下降,說明RD細(xì)胞的轉(zhuǎn)化特性減弱;3、在RD細(xì)胞中,部分PHB2疑似特異地定位于細(xì)胞核的核仁區(qū)域,而且RT-PCR方法初步證明了 PHB2表達(dá)沉默后,核仁中合成的45SrRNA含量下調(diào),提示PHB2可能參與核仁功能的調(diào)控,這可能是其參與調(diào)控RD細(xì)胞增殖過程的機(jī)制之一;4、PHB2表達(dá)沉默后,RD細(xì)胞中肌細(xì)胞分化前期標(biāo)志物myogenin的表達(dá)量上調(diào),說明PHB2表達(dá)沉默能增強(qiáng)RD細(xì)胞的分化能力。通過熒光素酶報告基因活性檢測進(jìn)一步證明PHB2表達(dá)沉默后myogenin的啟動子活性增加,提示了PHB2與細(xì)胞分化相關(guān)的一種可能的機(jī)制;5、采用Transwell檢測細(xì)胞遷移發(fā)現(xiàn)PHB2表達(dá)沉默對RD細(xì)胞的遷移能力沒有影響。
[Abstract]:PHB2 (inhibitor 2N 37KD) is an evolutionarily conserved multifunctional protein, widely distributed in bacteria, yeast, protozoa, plants, Drosophila, mammalian and other biological cells, participating in cell proliferation, differentiation and migration. Apoptosis, mitochondrial morphogenesis and other physiological processes, as well as regulation of cell cycle, gene transcription, and intracellular signal transduction. However, the study of PHB2 is still in its infancy, and many functions and mechanisms are still unclear. Rhabdomyosarcoma (Rhabdomyosarcoma) is a kind of soft tissue malignant tumor derived from primitive mesenchymal cells differentiated into rhabdomyosarcoma and composed of striated muscle cells of different degrees. The multiplicity of clinical manifestations, the multiplicity of pathological changes and the variability of the site of the disease make rhabdomyosarcoma one of the most complicated tumors in children. Our previous studies have found that PHB2 can inhibit skeletal muscle differentiation and rhabdomyosarcoma is characterized by excessive proliferation and differentiation defect of skeletal muscle progenitor cells. These results suggest that PHB2 may be related to the formation of rhabdomyosarcoma. Therefore, the expression of PHB2 in Rd cell line (Rhabdomyosarcoma cells) was silenced by RNA interference technique. The effects of PHB2 expression silencing on proliferation, differentiation and migration of Rd cell line were observed. To further explore the biological role of PHB2 in the development of rhabdomyosarcoma provides experimental and theoretical basis. The main contents are as follows: 1. The activity of Rd cells decreased after PHB2 expression silencing was detected by real time impedance cell analysis. The results of flow cytometry showed that the proportion of cells in G1 phase was increased after the expression of PHB2 was silenced, and the cells were blocked in G1 / S phase. Thus, the proliferation of Rd cells was inhibited. Clone formation assay in soft Agar showed that the ability of anchoring independent clone formation of Rd cells decreased after PHB2 expression silencing, which indicated that the transformation characteristics of Rd cells were weakened in R D cells. Some PHB2 were suspected to be located specifically in the nucleolus region of the nucleus, and the RT-PCR method preliminarily proved that the 45SrRNA content in the nucleolus was down-regulated after the silencing of PHB2 expression, suggesting that PHB2 might be involved in the regulation of nucleolar function. This may be one of the mechanisms involved in regulating the proliferation of Rd cells. After the silencing of PHB2 expression, the expression of myogenin in Rd cells is up-regulated, indicating that the silencing of PHB2 expression can enhance the differentiation ability of Rd cells. The detection of luciferase reporter gene activity further proved that the promoter activity of myogenin increased after PHB2 expression silencing. It is suggested that PHB2 may be a possible mechanism related to cell differentiation. The expression silencing of PHB2 has no effect on the migration ability of Rd cells by using Transwell to detect cell migration.
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R738.7

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本文編號：2159735