【摘要】：目的:觀察骨肉瘤高表達(dá)抗原乳頭瘤病毒結(jié)合因子(PBF)的改造表位是否有HLA-A2限制性抗腫瘤能力,開(kāi)發(fā)基于骨肉瘤的多肽免疫治療。方法:首先運(yùn)用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)PBF在骨肉瘤細(xì)胞系U2OS和Saos-2的表達(dá)情況。然后通過(guò)Net CTL 1.2、SYFPEITHI和IEDB軟件預(yù)測(cè)打分來(lái)選取PBF的HLA-A2限制性表位。替換PBF抗原錨定位點(diǎn)氨基酸獲得改造肽。候選表位肽的合成方法是標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc化學(xué)合成法,結(jié)合力實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)候選表位與T2A2細(xì)胞表面HLA-A2分子的結(jié)合能力,ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)候選表位肽誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)分泌干擾素γ(IFN-γ)的能力,乳酸脫氧酶(LDH)釋放實(shí)驗(yàn)和羧基熒光素琥珀酰亞胺脂(CFSE)細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)候選肽誘導(dǎo)CTL的能力。結(jié)果:PBF在骨肉瘤細(xì)胞系U2OS和Saos-2均有表達(dá),候選肽P75-1Y2L、P412-1Y、P416-1Y2L9V、P107-1Y和P435-1Y2L具有較好的結(jié)合力,且改造肽與HLA-A2的結(jié)合力高于原肽。ELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示表位肽P412、P412-1Y、P416、P416-1Y2L9V和P435-1Y2L誘導(dǎo)的CTL具有分泌IFN-γ的能力;P412-1Y和P416-1Y2L9V誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞免疫分泌的IFN-γ略高于原肽。LDH釋放實(shí)驗(yàn)和CFSE細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示表位P412、P412-1Y、P416和P416-1Y2L9V對(duì)U2OS細(xì)胞均有一定的殺傷作用,P412-1Y和P416-1Y2L9V特異性CTLs對(duì)U2OS細(xì)胞殺傷率高于原肽特異性CTLs。結(jié)論:PBF抗原改造表位P412-1Y和P416-1Y2L9V與天然表位P412和P416相比有更高的HLA-A2分子親和力,保留了原有的免疫原性,并且改造肽抗腫瘤免疫效應(yīng)強(qiáng)于天然表位。P412-1Y和P416-1Y2L9V是優(yōu)秀的PBF抗原的HLA-A*0201限制性CTL候選表位,可以成為新的抗腫瘤多肽免疫治療疫苗的候選表位。
[Abstract]:Aim: to investigate whether the modified epitope of high expression antigen papillomavirus binding factor (PBF) of osteosarcoma has HLA-A2 restricted antitumor ability and to develop polypeptide immunotherapy based on osteosarcoma. Methods: RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of PBF in osteosarcoma cell line U2OS and Saos-2. Then the HLA-A2 restricted epitopes of PBF were selected by Net CTL 1.2 Syssypetra and IEDB software prediction scoring. The modified peptide was obtained by replacing the amino acid at the anchoring site of PBF antigen. Candidate epitope peptides are synthesized by the standard Fmoc chemical synthesis method. The binding ability of candidate epitopes to HLA-A2 molecules on the surface of T2A2 cells was determined by binding assay. Elispot assay was used to detect the ability of candidate epitope peptides to induce the secretion of interferon 緯 (IFN- 緯) by (CTL) from cytotoxic T lymphocytes. The ability of candidate peptides to induce CTL was detected by lactate deoxylase (LDH) release assay and carboxyl fluorescein succinimide (CFSE) cytotoxicity assay. Results both U2OS and Saos-2 were expressed in human osteosarcoma cell line. The candidate peptide P75-1Y2LP412-1YP416-1Y2L9VX P107-1Y and P435-1Y2L had good binding ability. The binding ability of modified peptide to HLA-A2 was higher than that of propeptide. Elispot. The results showed that the epitope peptide P412P412-1YP416P416-1Y2L9V and CTL induced by P435-1Y2L had the ability to secrete IFN- 緯. P412-1Y and P416-1Y2L9V induced specific T cell immune secretion were slightly higher than those of propeptide. LDH release test and CFSE cells. The results showed that the cytotoxicity of epitope P412-1YP416 and P416-1Y2L9V to U2OS cells was higher than that of P412-1Y and P416-1Y2L9V specific CTLs. Conclusion compared with the natural epitopes P412 and P416, the modified epitopes P412-1Y and P416-1Y2L9V have higher HLA-A2 molecular affinity and retain the original immunogenicity. The modified peptides have stronger antitumor immune effect than natural epitopes. P412-1Y and P416-1Y2L9V are candidate epitopes of HLA-A*0201 restricted CTL for excellent PBF antigens, which can be used as candidate epitopes for new antitumor polypeptide immunotherapy vaccines.
【作者單位】： 許昌學(xué)院;漯河醫(yī)學(xué)高等�？茖W(xué)校;
【基金】：河南省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.142102310203) 漯河醫(yī)學(xué)高等�？茖W(xué)�？蒲谢鹳Y助項(xiàng)目(No.2017-SLMC-3)
【分類號(hào)】：R738.1

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