【摘要】：背景缺血-再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)是導(dǎo)致急性心肌梗死患者死亡的重要原因。研究發(fā)現(xiàn),心肌缺血-再灌注損傷是由許多矛盾因素相互作用造成的組織損害,其中炎癥是最重要的致病因素之一,并且對(duì)炎癥反應(yīng)進(jìn)行適度調(diào)控可有效緩解心肌缺血.再灌注損傷。膽堿能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway, CAP)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種具有免疫炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)功能的神經(jīng)生理機(jī)制,由迷走神經(jīng)、神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿和α7煙堿型乙酰膽堿受體(a7 subunit-containing nicotinic acetylcholine receptor, α7nAChR)所介導(dǎo)。研究證實(shí),迷走神經(jīng)電刺激可通過(guò)抑制全身和心肌局部炎癥反應(yīng)而明顯減輕心肌缺血-再灌注損傷。a7nAChR激動(dòng)劑同樣亦可激活CAP,與迷走神經(jīng)電刺激相比,其操作簡(jiǎn)便,臨床應(yīng)用前景好,因此我們選擇特異性a7nAChR激動(dòng)劑PNU282987進(jìn)行藥物干預(yù),觀察其對(duì)心肌缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)是線粒體膜上的一種重要通道性結(jié)構(gòu),是決定缺血-再灌注損傷時(shí)心肌細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵點(diǎn)。當(dāng)心肌發(fā)生缺血-再灌注損傷時(shí),MPTP可出現(xiàn)不可逆性高水平開(kāi)放,通過(guò)一系列病理生理學(xué)反應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡。糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)是一種廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。已經(jīng)證實(shí)多種干預(yù)措施的心肌保護(hù)效應(yīng)均與GSK-3β活性抑制有關(guān)。核轉(zhuǎn)錄因子κB (nuclear transcription factor κB, NF-κB)是炎癥反應(yīng)中的重要成分,可影響多種炎癥細(xì)胞因子的表達(dá),而GSK-3β可通過(guò)影響NF-κB而調(diào)控炎癥反應(yīng)。近期研究顯示,刺激迷走神經(jīng)可通過(guò)抑制GSK-3β活性而減輕家兔心肌缺血-再灌注后的心肌梗死面積。此外,GSK-3β有利于MPTP的開(kāi)放,敲除GSK-3p基因可提高M(jìn)PTP的開(kāi)放閡值。聯(lián)合不同干預(yù)措施以獲得更好的心肌保護(hù)效應(yīng)是心肌缺血-再灌注損傷研究的重要方向,因此本實(shí)驗(yàn)采用隨機(jī)對(duì)照的方法,觀察a7nAChR激動(dòng)劑后處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理能否產(chǎn)生協(xié)同性心肌保護(hù)作用,并觀察炎癥反應(yīng)、MPTP, GSK-3β在a7nAChR激動(dòng)劑后處理、肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理、聯(lián)合應(yīng)用a7nAChR激動(dòng)劑后處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理心肌保護(hù)作用中的地位和相互關(guān)系。初步探討這兩種干預(yù)措施發(fā)揮心肌保護(hù)作用的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)共分為三部分：第1部分PNU282987后處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理對(duì)心肌缺血-再灌注損傷保護(hù)效應(yīng)及其炎癥反應(yīng)抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究本部分實(shí)驗(yàn)旨在比較觀察特異性a7nAChR激動(dòng)劑PNU282987后處理、缺血預(yù)處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理對(duì)心肌缺血-再灌注損傷及其炎癥反應(yīng)的影響,并觀察聯(lián)合應(yīng)用PNU282987后處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理兩種干預(yù)措施能否產(chǎn)生更強(qiáng)的心肌保護(hù)效應(yīng)。60只健康雄性SD大鼠建立在體心肌缺血-再灌注損傷模型,隨機(jī)分成六組(每組10只)：空白對(duì)照組(S組)、對(duì)照組(C組)、缺血預(yù)處理組(IPC組)、PNU282987后處理組(P組)、肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理組(L組)、聯(lián)合應(yīng)用PNU282987后處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理組(P+L組)。所有大鼠開(kāi)胸后絲線穿過(guò)冠狀動(dòng)脈左前降支(left anterior descending coronary artery,LAD)做成活結(jié)。除S組外,所有大鼠均接受局部心肌缺血30 min(阻斷LAD)和再灌注120 min(開(kāi)放LAD)處理。C組無(wú)干預(yù)措施；IPC組在結(jié)扎LAD前實(shí)施3個(gè)循環(huán)缺血預(yù)處理,每個(gè)循環(huán)由5 min LAD阻斷和5 min LAD開(kāi)放組成；P組于再灌注前靜脈注射PNU282987 2.0mg/kg；L組于心肌缺血20 min時(shí)采用止血帶結(jié)扎大鼠雙側(cè)后肢造成缺血10 min,并在再灌注前開(kāi)放后肢血流灌注；P+L組于再灌注前靜脈注射PNU282987 2.0mg/kg并于心肌缺血20 min時(shí)采用止血帶結(jié)扎大鼠雙側(cè)后肢造成缺血10 min,在再灌注前開(kāi)放后肢血流灌注。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,連續(xù)監(jiān)測(cè)心率(heart rate, HR)、平均動(dòng)脈壓(mean arterial presure, MAP)和Ⅱ?qū)?lián)心電圖(ECG)。在再灌注120 min時(shí)抽取血標(biāo)本,采用大鼠專用試劑盒分別測(cè)定血清心肌肌鈣蛋白I (Cardiac Troponin-I, cTnI)、血清肌酸激酶心肌型同工酶(myocardial-bound creatine kinase, CK-MB)、血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α、TNF-α)、高遷移率組蛋白1 (high mobility group box 1 protein, HMGB1)、血清白介素-6(interleukin-6, IL-6)、血清白介素-10(interleukin-10,IL-10)等濃度。隨后采用伊文思藍(lán)和氯化三苯基四氮唑雙重染色檢測(cè)心肌梗死面積(infarct size,IS%)。結(jié)果顯示,各組大鼠的一般情況、心肌缺血前血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的基礎(chǔ)值和心肌缺血后15min的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較差異均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與C組相比,IPC組再灌注初期室性心律失常發(fā)生率顯著降低,室性心律失常評(píng)分也顯著降低。與C組相比,P組、L組和P+L組的IS%值、血清cTnI 和 CK-MB濃度均顯著降低；與IPC組相比,P組、L組和P+L組的IS%值和血清cTnI濃度顯著增高；與P組和L組相比,P+L組的IS%值、血清cTnI和CK-MB濃度均顯著降低。與S組相比,C組再灌注120 min時(shí)血清TNF-α、IL-6和HMGB1濃度顯著增高。與C組相比,IPC組、P組、L組和P+L組再灌注120 min時(shí)血清TNF-α、IL-6和HMGB1濃度顯著降低。與IPC和L組相比,P組和P+L組再灌注120 min時(shí)血清TNF-α、IL-6和HMGB1濃度顯著降低。第2部分MPTP功能狀態(tài)在PNU282987后處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理心肌保護(hù)效應(yīng)及其炎癥反應(yīng)抑制作用中地位的研究根據(jù)第1部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們?cè)O(shè)計(jì)了這部分實(shí)驗(yàn),目的是通過(guò)應(yīng)用MPTP開(kāi)放劑蒼術(shù)苷(Atractyloside, ATR)和抑制劑環(huán)孢素A (Cyclosporin A, CSA),觀察MPTP的開(kāi)放和抑制對(duì)PNU282987后處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理心肌保護(hù)效應(yīng)的影響,同時(shí)觀察炎癥反應(yīng)指標(biāo),了解心肌缺血-再灌注損傷過(guò)程中MPTP功能狀態(tài)、炎癥反應(yīng)、和心肌保護(hù)之間可能的相互聯(lián)系。120只健康雄性SD大鼠建立在體心肌缺血-再灌注損傷模型,隨機(jī)分成12組：對(duì)照組(C組)；PNU282987后處理組(P組)；肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理組(L組)；聯(lián)合應(yīng)用PNU282987后處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理組(P+L組)；缺血期使用環(huán)孢素A的對(duì)照組(CSA+C組)；缺血期使用環(huán)孢素A的PNU282987后處理組(CSA+P組)；缺血期使用環(huán)孢素A的肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理組(CSA+L組)；缺血期使用環(huán)孢素A的聯(lián)合應(yīng)用PNU282987后處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理組(CSA+P+L組);缺血期使用蒼術(shù)苷的對(duì)照組(ATR+C組)；缺血期使用蒼術(shù)苷的PNU282987后處理組(ATR+P組)；缺血期使用蒼術(shù)苷的肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理組(ATR+L組)；缺血期使用蒼術(shù)苷的聯(lián)合應(yīng)用PNU282987后處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理組(ATR+P+L組)。檢測(cè)項(xiàng)目同實(shí)驗(yàn)第1部分。結(jié)果顯示與C組相比,P組、L組、P+L組、CSA+C組、CSA+P組、CSA+L組和CSA+P+L組的IS%值、血清cTnI和CK-MB濃度均明顯減�。慌cCSA+C組相比,CSA+P組、CSA+L組和CSA+P+L組的IS%值、血清cTnI和CK-MB濃度均明顯減��；與CSA+P組和CSA+L組相比,CSA+P+L組的IS%值、血清cTnI和CK-MB濃度均明顯減小；C組、ATR+C組、ATR+P組、ATR+L組和ATR+P+L組五組IS%值、血清cTnI和CK-MB濃度之間比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與C組相比,血清TNF-α、IL-6和HMGB1濃度在P組、L組、P+L組、CSA+P組、CSA+L組、CSA+P+L組、ATR+P組、ATR+L組和ATR+P+L組顯著降低,在CSA+C組無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,在ATR+C組顯著升高；與CSA+C組相比,血清TNF-α、IL-6和HMGB1濃度在CSA+P組、CSA+L組和CSA+P+L組顯著降低；與CSA+P組相比,血清TNF-α、IL-6和HMGB1濃度在CSA+L組顯著升高,在CSA+P+L組無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與CSA+L組相比,血清TNF-α、 IL-6和HMGB1濃度在CSA+P+L組顯著降低；與ATR+C組相比,血清TNF-α、IL-6和HMGB1濃度在ATR+P組、ATR+L組和ATR+P+L組顯著降低。與ATR+P組相比,血清TNF-α、IL-6和HMGB1濃度在ATR+L組顯著升高,在ATR+P+L組無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與ATR+L組相比,血清TNF-α、IL-6和HMGB1濃度在ATR+P+L組顯著降低。第3部分：GSK-3β和炎癥反應(yīng)在PNU282987后處理和肢體遠(yuǎn)隔遠(yuǎn)隔缺血后處理心肌保護(hù)作用中的地位及其相互關(guān)系的研究60只雄性SD大鼠隨機(jī)分成四組：對(duì)照組(C組)；PNU282987后處理組(P組)；肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理組(L組)；聯(lián)合應(yīng)用PNU282987后處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理組(P+L組)。于再灌注120 min時(shí)取大鼠左心室缺血區(qū)心肌標(biāo)本。通過(guò)線粒體鈣離子保留能力(calcium retention capacity, CRC)檢測(cè)心肌細(xì)胞MPTP功能；通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative polymerase chain reaction, RQ-PCR)技術(shù)和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling, TUNEL)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平和心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)；通過(guò)免疫蛋白印跡分析(Western-blot)技術(shù)檢測(cè)GSK-3β、 p-GSK-3β(Ser9)、NF-κB、p-NF-κB(Ser536)等蛋白的相對(duì)表達(dá)量。CRC檢測(cè)結(jié)果顯示,與C組相比,P組、L組、P+L組缺血區(qū)心肌細(xì)胞線粒體的CRC明顯增加；與P組和L組相比,P+L組CRC明顯增加。RQ-PCR結(jié)果顯示,與C組相比,缺血區(qū)心肌Bcl-2 mRNA水平在P組、L組和P+L組明顯增高；與P組和L組相比,缺血區(qū)心肌Bcl-2 mRNA水平在P+L組明顯增高。與C組相比,缺血區(qū)心肌Bax mRNA水平在P組、L組和P+L組明顯降低；與P組和L組相比,缺血區(qū)心肌Bax mRNA水平在P+L組明顯降低。TUNEL法細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,與C組相比,心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)在P組、L組和P+L組明顯降低；與P組和L組相比,在P+L組明顯降低。Wester-Blot結(jié)果顯示,與C組相比,缺血區(qū)心肌組織p-GSK-3β (Ser9)蛋白相對(duì)灰度值在P組、L組、P+L組顯著增高；與P組相比,缺血區(qū)心肌組織p-GSK-3β (Ser9)蛋白相對(duì)灰度值在L組顯著降低,在P+L組無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與L組相比,缺血區(qū)心肌組織p-GSK-3β (Ser9)蛋白相對(duì)灰度值在P+L組顯著增高；與C組相比,缺血區(qū)心肌組織p-NF-κBp65 (Ser536)蛋白相對(duì)灰度值在P組、L組和P+L組顯著降低；與P組相比,缺血區(qū)心肌組織p-NF-κBp65(Ser536)蛋白相對(duì)灰度值在L組顯著增高,在P+L組無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與L組相比,缺血區(qū)心肌組織p-NF-κBp65 (Ser536)蛋白相對(duì)灰度值在P+L組顯著降低。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)通過(guò)以實(shí)驗(yàn)大鼠在體心肌缺血-再灌注損傷模型的研究表明：1、缺血預(yù)處理、PNU282987后處理、肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理均可產(chǎn)生明顯的心肌保護(hù)作用,但是三種干預(yù)措施中缺血預(yù)處理減小心肌梗死面積的作用最強(qiáng),PNU282987后處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理的效果較弱,但是聯(lián)合應(yīng)用PNU282987后處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理可獲得顯著增強(qiáng)的心肌保護(hù)效果。2、缺血預(yù)處理、PNU282987后處理、肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理、聯(lián)合應(yīng)用PNU282987后處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理均能明顯抑制心肌缺血-再灌注損傷引起的炎癥反應(yīng),其中PNU282987后處理以及聯(lián)合應(yīng)用PNU282987后處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理抑制炎癥反應(yīng)的作用最強(qiáng)。3、MPTP抑制劑本身具有心肌保護(hù)作用,不影響PNU282987后處理、肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理以及聯(lián)合應(yīng)用PNU282987后處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理的心肌保護(hù)效應(yīng)和炎癥抑制作用。MPTP開(kāi)放劑則可完全消除PNU282987后處理、肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理以及聯(lián)合應(yīng)用PNU282987后處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理的心肌保護(hù)效應(yīng),但不影響三種干預(yù)措施的炎癥反應(yīng)抑制作用。4、PNU282987后處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理可通過(guò)抑制GSK-3β活性而顯著抑制炎癥反應(yīng)和MPTP開(kāi)放,顯著減少心肌細(xì)胞凋亡,產(chǎn)生明顯的心肌保護(hù)作用。聯(lián)合應(yīng)用PNU282987后處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理可增強(qiáng)MPTP抑制作用和心肌保護(hù)效果。5、PUN282987后處理和肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理可通過(guò)抑制GSK-3β活性,相應(yīng)地抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性,從而抑制炎癥反應(yīng)。兩者聯(lián)合應(yīng)用的抑制炎癥效果與單獨(dú)應(yīng)用PUN282987后處理相當(dāng),提示PUN282987后處理的心肌保護(hù)作用機(jī)制中以抗炎作用為主導(dǎo),而肢體遠(yuǎn)隔缺血后處理則更依賴其他途徑
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R614
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本文編號(hào)：2141622