本文選題：椎間盤退變 + 髓核細(xì)胞��； 參考：《東南大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：目的：體外建立人髓核細(xì)胞復(fù)制性老化和血清剝奪誘導(dǎo)老化的模型,探索兩種老化髓核細(xì)胞對(duì)正常髓核細(xì)胞的致退變效應(yīng)并探索其機(jī)制。方法：1、體外連續(xù)傳代、培養(yǎng)人正常髓核細(xì)胞,模擬髓核細(xì)胞復(fù)制性老化過程；2、體外無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)第9代髓核細(xì)胞,誘導(dǎo)髓核細(xì)胞老化；3、分別對(duì)步驟1中的各代細(xì)胞及步驟2中的細(xì)胞行顯微鏡觀察髓核細(xì)胞形態(tài)、SA-β-Gal染色計(jì)數(shù)細(xì)胞老化率、流式細(xì)胞儀檢測(cè)G1期細(xì)胞比例,制備兩組髓核細(xì)胞老化模型(本研究中擬定老化率≥80%、G1期細(xì)胞≥80%的造模組為合格的髓核細(xì)胞老化模型)；4、免疫熒光法觀察P9代髓核細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá),同時(shí)對(duì)第9代髓核細(xì)胞、復(fù)制性老化模型、血清剝奪誘導(dǎo)老化模型3組細(xì)胞,采用QRT-PCR檢測(cè)3組細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)含量；5、建立老化髓核細(xì)胞和正常髓核細(xì)胞共培養(yǎng)體系,觀察共培養(yǎng)體系中正常髓核細(xì)胞的活力指標(biāo),Western-blot檢測(cè)共培養(yǎng)體系中正常髓核細(xì)胞中ERK. Akt兩條信號(hào)傳導(dǎo)通路的表達(dá)情況。結(jié)果：1、在建立髓核細(xì)胞復(fù)制性老化模型過程中,隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加,髓核細(xì)胞形態(tài)逐漸由類圓形、星形、短梭形向長(zhǎng)梭形、不規(guī)則形等轉(zhuǎn)變,細(xì)胞體積逐漸增大、胞質(zhì)變脆、胞漿空泡化明顯。SA-β-Gal染色計(jì)數(shù)髓核細(xì)胞老化率、流式細(xì)胞儀檢測(cè)G1期細(xì)胞比例,傳至P13代時(shí)兩者比例分別為84.13±4.7%、87.59±3.0%；2、在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)髓核細(xì)胞的模型中,第7d觀察髓核細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則形、長(zhǎng)梭形轉(zhuǎn)變,胞質(zhì)變脆、胞漿空泡化明顯。SA-β-Gal染色計(jì)數(shù)髓核細(xì)胞老化率、流式細(xì)胞儀檢測(cè)G1期細(xì)胞比例較含10%胎牛血清組明顯增高,其中SA-β-Gal染色計(jì)數(shù)髓核細(xì)胞老化率為86.70±6.0%,流式細(xì)胞儀檢測(cè)G1期細(xì)胞比例為88.34±4.4%；3、免疫熒光法檢測(cè)提示P9代髓核細(xì)胞表達(dá)TGF-β1, QRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在復(fù)制性老化模型和血清剝奪誘導(dǎo)老化模型中,TGF-β1的表達(dá)量較正常髓核細(xì)胞均有所減少,差異較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),兩個(gè)老化模型組中TGF-β1的表達(dá)量相近,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；4、在老化髓核細(xì)胞與正常髓核細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,第7d觀察共培養(yǎng)體系中正常髓核細(xì)胞的活力指標(biāo),發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組A(復(fù)制老化髓核細(xì)胞(P13代)與正常髓核細(xì)胞共培養(yǎng))、實(shí)驗(yàn)組B(血清剝奪誘導(dǎo)老化的髓核細(xì)胞與正常髓核細(xì)胞共培養(yǎng))中老化率及G1期細(xì)胞比例較對(duì)照組(單純正常髓核細(xì)胞培養(yǎng))中均有所上升,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；Western-blot檢測(cè)提示對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組A、實(shí)驗(yàn)組B中正常髓核細(xì)胞中ERK、Akt表達(dá)無明顯差異,實(shí)驗(yàn)組A、實(shí)驗(yàn)組B中正常髓核細(xì)胞的pERK.pAkt較對(duì)照組表達(dá)減少。結(jié)論：1、通過體外連續(xù)性傳代培養(yǎng)人正常髓核細(xì)胞(至P13代髓核細(xì)胞),其老化率及G1期細(xì)胞比例逐漸增加,成功建立髓核細(xì)胞復(fù)制性老化模型；2、通過體外無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人正常髓核細(xì)胞,其老化率及G1期細(xì)胞比例較含10%胎牛血清組明顯增高,成功建立血清剝奪誘導(dǎo)髓核細(xì)胞老化模型；3、人髓核細(xì)胞中可表達(dá)TGF-β1,兩個(gè)老化模型組髓核細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)較正常髓核細(xì)胞減少；4、老化髓核細(xì)胞與正常髓核細(xì)胞共培養(yǎng)可加速正常髓核細(xì)胞老化,與老化髓核細(xì)胞共培養(yǎng)組中的正常髓核細(xì)胞中ERK、Akt兩條信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化相對(duì)減少。
[Abstract]:Objective : To establish a model of human nucleus pulposus cell replicative aging and serum deprivation induced aging in vitro , explore the effect of two aging nucleus pulposus cells on normal nucleus pulposus cells and explore its mechanism .
2 . No serum - free medium was cultured in vitro for the ninth generation of nucleus pulposus cells , which induced the aging of nucleus pulposus cells .
3 , observing the morphology of the nucleus pulposus cells , the SA - beta - Gal staining counting cell aging rate and the flow cytometry to detect the cell aging rate of the nucleus pulposus cells in each of the cells in the step 1 and the cell line microscope in the step 2 , and preparing two groups of nucleus pulposus cell aging models ( the aging rate is not more than or equal to 80 percent in the study , and the G1 phase cells are more than or equal to 80 percent of the cell modules are qualified nucleus pulposus cell aging models ) ;
4 . The expression of TGF - 尾1 in the nucleus pulposus cells was observed by immunofluorescence . At the same time , the expression of TGF - 尾1 was detected by QRT - PCR in the 3rd generation nucleus pulposus cells , the replicative aging model , the serum deprivation induced aging model 3 cells .
5 . Establish the co - culture system of aged nucleus pulposus cells and normal nucleus pulposus cells , observe the activity index of normal nucleus pulposus cells in the co - culture system , and detect ERK in normal nucleus pulposus cells in the co - culture system by Western - blot . Results : 1 . In the process of establishing the replicative aging model of nucleus pulposus cells , the morphology of nucleus pulposus cells gradually increased with the increase of the number of cells passaged , the shape of nucleus pulposus cells gradually changed from round shape , star shape , short spindle shape to long shuttle shape , irregular shape and so on .
2 . In the model of culturing the nucleus pulposus cells without serum culture medium , the morphology of the nucleus pulposus cells was observed on the 7th day , the morphology of the cells was irregular , the cytoplasmic vacuolation was obvious . The aging rate of the nucleus pulposus cells was significantly increased by the SA - 尾 - Gal staining . The aging rate of the SA - 尾 - Gal staining was 86.70 鹵 6.0 % , and the percentage of the flow cytometry was 88.34 鹵 4.4 % .
3 . The expression levels of TGF - 尾1 and QRT - PCR showed that TGF - 尾1 was decreased in the model of replication and the model of serum deprivation induced aging ( P0.05 ) . The expression of TGF - 尾1 was similar between the two aging models ( P0.05 ) .
4 . In the co - culture system of aged nucleus pulposus cells and normal nucleus pulposus cells , the activity index of normal nucleus pulposus cells in the co - culture system was observed on the 7th day . In the experimental group , the aging rate and the percentage of G1 phase in the experimental group B ( the cultured nucleus pulposus cells were co - cultured with normal nucleus pulposus cells ) were higher than those in the control group ( normal nucleus pulposus cells ) , and the difference was not statistically significant ( P0.05 ) .
Western - blot analysis showed that there was no significant difference in the expression of ERK in normal nucleus pulposus cells in experimental group A and experimental group B . Conclusion : 1 . The aging rate and the percentage of G1 phase of normal nucleus pulposus cells in experimental group A and experimental group B were gradually increased , and the replication - aging model of nucleus pulposus cells was established successfully .
2 . Normal nucleus pulposus cells were cultured in vitro without serum culture medium . The aging rate and the percentage of G1 phase cells were significantly higher than those in 10 % fetal bovine serum group , and the aging model of serum deprivation induced nucleus pulposus cells was established successfully .
3 . TGF - 尾1 can be expressed in human nucleus pulposus cells , and the expression of TGF - 尾1 in the nucleus pulposus cells of two aging models was lower than that of normal nucleus pulposus cells .
4 . The co - culture of aged nucleus pulposus cells with normal nucleus pulposus cells can accelerate the aging of normal nucleus pulposus cells , and the activation of two signal transduction pathways in normal nucleus pulposus cells in the co - culture group with aged nucleus pulposus cells is relatively reduced .
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R681.5

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本文編號(hào)：2109763