本文選題：IL-1β + 無血清�。� 參考：《重慶醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：腰痛(low back pain,LBP)是導致現代人活動功能障礙,影響生活質量的常見原因,現階段臨床尚缺乏有效的治療手段。椎間盤退變(intervertebral disc degeneration,IVD)被認為是導致腰痛的重要原因,但其確切發(fā)病機制并不清楚。既往研究表明炎癥因子與椎間盤退變誘導的盤源性腰痛密切相關,白介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)是其中研究較為廣泛的一個因子。但IL-1β對人退變髓核細胞(nucleus pulposus cells,NPCs)凋亡和分解代謝的影響及其調控機制尚缺乏系統(tǒng)研究。本課題擬從IL-1β通過線粒體途徑誘導NPCs凋亡;IL-1β介導的線粒體損傷激活了NPCs自噬;自噬抑制IL-1β誘導的NPCs凋亡;SIRT1通過TLR2/NF-κB信號通路抑制IL-1β對胞外基質的分解作用四個方面分別進行闡述。第一部分IL-1β通過線粒體途徑誘導NPCs凋亡目的探討IL-1β是否通過線粒體途徑介導退變NPCs凋亡。方法將來自于正常和退變組的髓核組織,采用western blot、免疫組化和TUNEL染色分別原位比較IL-1β表達和細胞凋亡情況。采用酶序貫消化法分離、培養(yǎng)退變組的髓核細胞。以不同濃度IL-1β作用后,Annexin V/PI流式細胞術檢測細胞凋亡,CCK-8檢測細胞增殖以此篩選最佳作用濃度。分別采用大體形態(tài)觀察、Hoechst 33258染色和流式細胞術檢測血清存在與否對IL-1β誘導NPCs凋亡是否存在影響。Western blot檢測線粒體凋亡通路關鍵蛋白Bax、Bcl-2和細胞色素C;DCFH-DA熒光探針檢測細胞內ROS表達量;酶標儀測定線粒體凋亡通路最后執(zhí)行蛋白caspase-3和caspase-9酶活性。結果退變髓核組織中IL-1β表達和細胞凋亡數均要顯著高于正常組(P㩳0.05),提示IL-1β高表達與退變髓核中細胞凋亡增高存在聯(lián)系。篩選出10ng/ml濃度IL-1β為最佳亞致死劑量。在血清剝奪條件下,IL-1β可以明顯誘導NPCs凋亡(P㩳0.05),但正常培養(yǎng)條件下血清可以中和IL-1β的細胞毒性作用。IL-1β可以明顯誘導Bax/Bcl-2蛋白表達比增高(P㩳0.05),以及促進Cyt C從線粒體釋放入胞質中,提示線粒體凋亡通路被激活;ROS和caspase酶活性檢測進一步表明,IL-β作用可以明顯提高NPCs內ROS表達(P㩳0.05),以及顯著提高caspase-3和caspase-9酶活性(P㩳0.05)。結論IL-1β在無血清條件下,可以通過線粒體途徑明顯誘導退變NPCs凋亡。第二部分IL-1β介導的線粒體損傷激活了NPCs自噬目的探討IL-1β對NPCs的線粒體是否具有直接損傷作用,損傷的線粒體能否進一步激活自噬。方法以10%FBS正常培養(yǎng)組作為對照,在血清剝奪條件下加或不加10ng/ml IL-1β刺激,采用JC-1染色檢測線粒體膜電位,ATP檢測試劑盒測定細胞內ATP合成量,透射電鏡直接觀察線粒體超微結構,直接判斷IL-1β對線粒體損傷的作用。另一方面,Western blot測定自噬相關蛋白LC3和P62;為了更加直接觀察IL-1β對自噬的影響,采用含GFP-LC3腺病毒轉染NPCs,觀察綠色熒光斑點數,以此判斷自噬激活器情況;為了進一步驗證IL-1β對自噬的激活作用是因為激活了“自噬流”還是阻礙了自噬的降解,采用自噬的抑制劑0.1μmol/L Bafilomycin A1(BAF)預處理2h再檢測LC3和P62的表達;最后采用經典透射電鏡觀察自噬體判斷在IL-1β作用下NPCs內自噬的表達情況。結果在血清剝奪條件下可以導致線粒體膜電位適度下降,但一旦加入IL-1β作用,膜電位則進一步顯著降低(P㩳0.05);雖然0%FBS培養(yǎng)條件下ATP合成量與對照組無明顯差別(P㧐0.05),但IL-1β顯著降低了ATP合成(P㩳0.05);電鏡觀察結果顯示0%FBS組線粒體形態(tài)發(fā)生腫脹或空泡樣變性;而在IL-1β炎性刺激下,線粒體形態(tài)進一步改變,發(fā)生基質固縮,線粒體內嵴斷裂,外膜完整性消失。上述結果提示IL-1β可以明顯誘導線粒體發(fā)生損傷。進一步研究結果顯示,IL-1β作用下顯著提高了LC3-II/LC3-I蛋白表達比,而降低了P62表達,提示IL-1β可以激活退變NPCs內細胞自噬。GFP-LC3激光共聚焦結果進一步證實,IL-1β處理后細胞內綠色熒光斑點數顯著增多。接著采用BAF處理后,western blot結果顯示LC3-II/LC3-I表達比和P62蛋白表達均顯著上升(P㩳0.05),由此證明IL-1β激活了NPCs自噬流爆發(fā),而非阻礙了自噬的降解。透射電鏡直接觀察結果表明0%FBS+IL-1β組觀察到不僅自噬體數量增多,還可以在個別自噬-溶酶體內觀察到尚未被完全消化的線粒體結構,進一步證明了IL-1β介導的自噬具有清除損傷線粒體的作用。結論IL-1β介導了退變NPCs線粒體損傷,并進一步激活了自噬。第三部分自噬抑制IL-1β誘導的NPCs凋亡目的探討IL-1β所激活的自噬對NPCs凋亡影響。方法采用自噬的特異性抑制劑3-MA(5mmol/L)預處理NPCs后,流式細胞術檢測細胞凋亡率,JC-1染色檢測對線粒體膜電位影響。為進一步驗證IL-1β所激活的自噬是否為代償性的線粒體自噬(mitophagy),western blot分別檢測了mitophagy的關鍵誘導蛋白Parklin的線粒體和胞質表達。采用自噬激動劑RAP(50nmol/L)預處理后,同時轉染Ad-GFP-LC3和Ad-HBm Tur-Mito腺病毒,其中GFP-LC3標記自噬體,而HBm Tur-Mito標記線粒體,轉染后通過激光共聚焦觀察共定位情況,以此判斷是否發(fā)生了線粒體自噬。結果3-MA抑制NPCs中自噬活性后,細胞凋亡顯著增加(P㩳0.05),線粒體膜電位則進一步降低(P㩳0.05),說明自噬被抑制后,NPCs線粒體功能受到了進一步破壞。加入IL-1β刺激后發(fā)現Parkin在線粒體上的表達明顯上升(P㩳0.05),而在胞質中的表達明顯下降(P㩳0.05),說明其發(fā)生了線粒體轉位,提示誘導了mitophagy。而加入自噬激動劑RAP后,黃色熒光斑點進一步增多,證明IL-1β所激活的自噬與線粒體自噬有關。結論IL-1β介導的自噬激活,具有代償性保護NPCs凋亡作用,部分參與了線粒體自噬地發(fā)生。第四部分SIRT1通過TLR2/NF-κB信號通路抑制IL-1β對胞外基質分解作用目的探討在IL-1β促分解作用下,SIRT1對ECM的調控作用及其潛在機制。方法將來自于正常和退變組的髓核組織,采用免疫組化檢測SIRT1、MMP-3和MMP-13原位表達,western blot檢測各個髓核組織中SIRT1、II型膠原和aggrecan蛋白表達差異。采用SIRT1過表達慢病毒和SIRT1-si RNA慢病毒靶向調控NPCs中SIRT1表達,探討對ECM的表達調控作用。采用western blot、免疫共沉淀和細胞免疫熒光進一步探討SIRT1是否通過TLR2/NF-κB信號通路參與了ECM表達調控。結果組織的免疫組化和western blot結果顯示SIRT1在退變髓核髓核中表達明顯下降,而基質降解酶MMP-3和MMP-13表達明顯升高,伴隨著ECM主要成分COL2A1和aggrecan表達降低。這一結果提示SIRT1與ECM表達之間存在密切聯(lián)系。采用慢病毒靶向調控SIRT1表達后發(fā)現,SIRT1過表達可以明顯抑制IL-1β對COL2A1和aggrecan地降解作用,而沉默SIRT1表達可以明顯增加MMP-3和MMP-13表達。提示SIRT1能夠抑制IL-1β對ECM降解作用。進一步探討其潛在機制發(fā)現,在加入IL-1β刺激后,TLR2-NF-κB通路被激活,免疫共沉淀顯示SIRT1與P65之間存在相互作用關系,SIRT1過表達后,TLR2以及P65的總蛋白、乙�；鞍妆磉_均降低。此外,當P65表達降低后,MMP-3和MMP-13的表達也隨之降低。免疫熒光顯示IL-1β所誘導的P65核轉位,并不受TLR2表達沉默的影響。由此我們初步揭示了在IL-1β作用下SIRT1與TLR2-NF-κB通路相互關系。結論SIRT1通過TLR2/NF-κB信號通路抑制IL-1β對胞外基質分解作用。
[Abstract]:Interleukin - 1尾 ( IL - 1尾 ) induced NPCs apoptosis by mitochondrial pathway . IL - 1尾 ( IL - 1尾 ) induced apoptosis of NPCs by mitochondrial pathway . In order to further verify the effect of IL - 1尾 on autophagy , it was suggested that IL - 1尾 could significantly decrease the expression of LC3 - II / LC3 - I . The expression of IL - 1尾 in nucleus pulposus of nucleus pulposus was significantly inhibited by Western blot . The expression of IL - 1尾 in nucleus pulposus was significantly inhibited by Western blot , and the expression of MMP - 3 and MMP - 13 was decreased .
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R681.53

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本文編號：2007376