本文選題：IL-1β + 無(wú)血清��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：腰痛(low back pain,LBP)是導(dǎo)致現(xiàn)代人活動(dòng)功能障礙,影響生活質(zhì)量的常見原因,現(xiàn)階段臨床尚缺乏有效的治療手段。椎間盤退變(intervertebral disc degeneration,IVD)被認(rèn)為是導(dǎo)致腰痛的重要原因,但其確切發(fā)病機(jī)制并不清楚。既往研究表明炎癥因子與椎間盤退變誘導(dǎo)的盤源性腰痛密切相關(guān),白介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)是其中研究較為廣泛的一個(gè)因子。但I(xiàn)L-1β對(duì)人退變髓核細(xì)胞(nucleus pulposus cells,NPCs)凋亡和分解代謝的影響及其調(diào)控機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)研究。本課題擬從IL-1β通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)NPCs凋亡;IL-1β介導(dǎo)的線粒體損傷激活了NPCs自噬;自噬抑制IL-1β誘導(dǎo)的NPCs凋亡;SIRT1通過(guò)TLR2/NF-κB信號(hào)通路抑制IL-1β對(duì)胞外基質(zhì)的分解作用四個(gè)方面分別進(jìn)行闡述。第一部分IL-1β通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)NPCs凋亡目的探討IL-1β是否通過(guò)線粒體途徑介導(dǎo)退變NPCs凋亡。方法將來(lái)自于正常和退變組的髓核組織,采用western blot、免疫組化和TUNEL染色分別原位比較IL-1β表達(dá)和細(xì)胞凋亡情況。采用酶序貫消化法分離、培養(yǎng)退變組的髓核細(xì)胞。以不同濃度IL-1β作用后,Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖以此篩選最佳作用濃度。分別采用大體形態(tài)觀察、Hoechst 33258染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血清存在與否對(duì)IL-1β誘導(dǎo)NPCs凋亡是否存在影響。Western blot檢測(cè)線粒體凋亡通路關(guān)鍵蛋白Bax、Bcl-2和細(xì)胞色素C;DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)量;酶標(biāo)儀測(cè)定線粒體凋亡通路最后執(zhí)行蛋白caspase-3和caspase-9酶活性。結(jié)果退變髓核組織中IL-1β表達(dá)和細(xì)胞凋亡數(shù)均要顯著高于正常組(P㩳0.05),提示IL-1β高表達(dá)與退變髓核中細(xì)胞凋亡增高存在聯(lián)系。篩選出10ng/ml濃度IL-1β為最佳亞致死劑量。在血清剝奪條件下,IL-1β可以明顯誘導(dǎo)NPCs凋亡(P㩳0.05),但正常培養(yǎng)條件下血清可以中和IL-1β的細(xì)胞毒性作用。IL-1β可以明顯誘導(dǎo)Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比增高(P㩳0.05),以及促進(jìn)Cyt C從線粒體釋放入胞質(zhì)中,提示線粒體凋亡通路被激活;ROS和caspase酶活性檢測(cè)進(jìn)一步表明,IL-β作用可以明顯提高NPCs內(nèi)ROS表達(dá)(P㩳0.05),以及顯著提高caspase-3和caspase-9酶活性(P㩳0.05)。結(jié)論IL-1β在無(wú)血清條件下,可以通過(guò)線粒體途徑明顯誘導(dǎo)退變NPCs凋亡。第二部分IL-1β介導(dǎo)的線粒體損傷激活了NPCs自噬目的探討IL-1β對(duì)NPCs的線粒體是否具有直接損傷作用,損傷的線粒體能否進(jìn)一步激活自噬。方法以10%FBS正常培養(yǎng)組作為對(duì)照,在血清剝奪條件下加或不加10ng/ml IL-1β刺激,采用JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位,ATP檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP合成量,透射電鏡直接觀察線粒體超微結(jié)構(gòu),直接判斷IL-1β對(duì)線粒體損傷的作用。另一方面,Western blot測(cè)定自噬相關(guān)蛋白LC3和P62;為了更加直接觀察IL-1β對(duì)自噬的影響,采用含GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染NPCs,觀察綠色熒光斑點(diǎn)數(shù),以此判斷自噬激活器情況;為了進(jìn)一步驗(yàn)證IL-1β對(duì)自噬的激活作用是因?yàn)榧せ盍恕白允闪鳌边�是阻礙了自噬的降解,采用自噬的抑制劑0.1μmol/L Bafilomycin A1(BAF)預(yù)處理2h再檢測(cè)LC3和P62的表達(dá);最后采用經(jīng)典透射電鏡觀察自噬體判斷在IL-1β作用下NPCs內(nèi)自噬的表達(dá)情況。結(jié)果在血清剝奪條件下可以導(dǎo)致線粒體膜電位適度下降,但一旦加入IL-1β作用,膜電位則進(jìn)一步顯著降低(P㩳0.05);雖然0%FBS培養(yǎng)條件下ATP合成量與對(duì)照組無(wú)明顯差別(P㧐0.05),但I(xiàn)L-1β顯著降低了ATP合成(P㩳0.05);電鏡觀察結(jié)果顯示0%FBS組線粒體形態(tài)發(fā)生腫脹或空泡樣變性;而在IL-1β炎性刺激下,線粒體形態(tài)進(jìn)一步改變,發(fā)生基質(zhì)固縮,線粒體內(nèi)嵴斷裂,外膜完整性消失。上述結(jié)果提示IL-1β可以明顯誘導(dǎo)線粒體發(fā)生損傷。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示,IL-1β作用下顯著提高了LC3-II/LC3-I蛋白表達(dá)比,而降低了P62表達(dá),提示IL-1β可以激活退變NPCs內(nèi)細(xì)胞自噬。GFP-LC3激光共聚焦結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),IL-1β處理后細(xì)胞內(nèi)綠色熒光斑點(diǎn)數(shù)顯著增多。接著采用BAF處理后,western blot結(jié)果顯示LC3-II/LC3-I表達(dá)比和P62蛋白表達(dá)均顯著上升(P㩳0.05),由此證明IL-1β激活了NPCs自噬流爆發(fā),而非阻礙了自噬的降解。透射電鏡直接觀察結(jié)果表明0%FBS+IL-1β組觀察到不僅自噬體數(shù)量增多,還可以在個(gè)別自噬-溶酶體內(nèi)觀察到尚未被完全消化的線粒體結(jié)構(gòu),進(jìn)一步證明了IL-1β介導(dǎo)的自噬具有清除損傷線粒體的作用。結(jié)論IL-1β介導(dǎo)了退變NPCs線粒體損傷,并進(jìn)一步激活了自噬。第三部分自噬抑制IL-1β誘導(dǎo)的NPCs凋亡目的探討IL-1β所激活的自噬對(duì)NPCs凋亡影響。方法采用自噬的特異性抑制劑3-MA(5mmol/L)預(yù)處理NPCs后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,JC-1染色檢測(cè)對(duì)線粒體膜電位影響。為進(jìn)一步驗(yàn)證IL-1β所激活的自噬是否為代償性的線粒體自噬(mitophagy),western blot分別檢測(cè)了mitophagy的關(guān)鍵誘導(dǎo)蛋白Parklin的線粒體和胞質(zhì)表達(dá)。采用自噬激動(dòng)劑RAP(50nmol/L)預(yù)處理后,同時(shí)轉(zhuǎn)染Ad-GFP-LC3和Ad-HBm Tur-Mito腺病毒,其中GFP-LC3標(biāo)記自噬體,而HBm Tur-Mito標(biāo)記線粒體,轉(zhuǎn)染后通過(guò)激光共聚焦觀察共定位情況,以此判斷是否發(fā)生了線粒體自噬。結(jié)果3-MA抑制NPCs中自噬活性后,細(xì)胞凋亡顯著增加(P㩳0.05),線粒體膜電位則進(jìn)一步降低(P㩳0.05),說(shuō)明自噬被抑制后,NPCs線粒體功能受到了進(jìn)一步破壞。加入IL-1β刺激后發(fā)現(xiàn)Parkin在線粒體上的表達(dá)明顯上升(P㩳0.05),而在胞質(zhì)中的表達(dá)明顯下降(P㩳0.05),說(shuō)明其發(fā)生了線粒體轉(zhuǎn)位,提示誘導(dǎo)了mitophagy。而加入自噬激動(dòng)劑RAP后,黃色熒光斑點(diǎn)進(jìn)一步增多,證明IL-1β所激活的自噬與線粒體自噬有關(guān)。結(jié)論IL-1β介導(dǎo)的自噬激活,具有代償性保護(hù)NPCs凋亡作用,部分參與了線粒體自噬地發(fā)生。第四部分SIRT1通過(guò)TLR2/NF-κB信號(hào)通路抑制IL-1β對(duì)胞外基質(zhì)分解作用目的探討在IL-1β促分解作用下,SIRT1對(duì)ECM的調(diào)控作用及其潛在機(jī)制。方法將來(lái)自于正常和退變組的髓核組織,采用免疫組化檢測(cè)SIRT1、MMP-3和MMP-13原位表達(dá),western blot檢測(cè)各個(gè)髓核組織中SIRT1、II型膠原和aggrecan蛋白表達(dá)差異。采用SIRT1過(guò)表達(dá)慢病毒和SIRT1-si RNA慢病毒靶向調(diào)控NPCs中SIRT1表達(dá),探討對(duì)ECM的表達(dá)調(diào)控作用。采用western blot、免疫共沉淀和細(xì)胞免疫熒光進(jìn)一步探討SIRT1是否通過(guò)TLR2/NF-κB信號(hào)通路參與了ECM表達(dá)調(diào)控。結(jié)果組織的免疫組化和western blot結(jié)果顯示SIRT1在退變髓核髓核中表達(dá)明顯下降,而基質(zhì)降解酶MMP-3和MMP-13表達(dá)明顯升高,伴隨著ECM主要成分COL2A1和aggrecan表達(dá)降低。這一結(jié)果提示SIRT1與ECM表達(dá)之間存在密切聯(lián)系。采用慢病毒靶向調(diào)控SIRT1表達(dá)后發(fā)現(xiàn),SIRT1過(guò)表達(dá)可以明顯抑制IL-1β對(duì)COL2A1和aggrecan地降解作用,而沉默SIRT1表達(dá)可以明顯增加MMP-3和MMP-13表達(dá)。提示SIRT1能夠抑制IL-1β對(duì)ECM降解作用。進(jìn)一步探討其潛在機(jī)制發(fā)現(xiàn),在加入IL-1β刺激后,TLR2-NF-κB通路被激活,免疫共沉淀顯示SIRT1與P65之間存在相互作用關(guān)系,SIRT1過(guò)表達(dá)后,TLR2以及P65的總蛋白、乙�；鞍妆磉_(dá)均降低。此外,當(dāng)P65表達(dá)降低后,MMP-3和MMP-13的表達(dá)也隨之降低。免疫熒光顯示IL-1β所誘導(dǎo)的P65核轉(zhuǎn)位,并不受TLR2表達(dá)沉默的影響。由此我們初步揭示了在IL-1β作用下SIRT1與TLR2-NF-κB通路相互關(guān)系。結(jié)論SIRT1通過(guò)TLR2/NF-κB信號(hào)通路抑制IL-1β對(duì)胞外基質(zhì)分解作用。
[Abstract]:Interleukin - 1尾 ( IL - 1尾 ) induced NPCs apoptosis by mitochondrial pathway . IL - 1尾 ( IL - 1尾 ) induced apoptosis of NPCs by mitochondrial pathway . In order to further verify the effect of IL - 1尾 on autophagy , it was suggested that IL - 1尾 could significantly decrease the expression of LC3 - II / LC3 - I . The expression of IL - 1尾 in nucleus pulposus of nucleus pulposus was significantly inhibited by Western blot . The expression of IL - 1尾 in nucleus pulposus was significantly inhibited by Western blot , and the expression of MMP - 3 and MMP - 13 was decreased .
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R681.53

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本文編號(hào)：2007376