本文選題：腺苷酸A2A受體 + 腸膠質(zhì)細(xì)胞�。� 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景研究表明,各種大型手術(shù)以及急性戰(zhàn)創(chuàng)傷引起的急性小腸缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)損傷已成為臨床常見(jiàn)的誘發(fā)腸黏膜屏障(intestinal epithelial barrier,IEB)損傷、腸衰竭,甚至多器官障礙的重要原因之一[1-3]。作為腸道神經(jīng)系統(tǒng)最豐富的細(xì)胞類型,腸膠質(zhì)細(xì)胞(enteric glial cell,EGC)已被證實(shí)與IEB功能調(diào)控關(guān)系密切[4]。研究顯示,EGC不僅在腸神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)支持和保護(hù)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用,同時(shí)也在保持IEB結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)定性方面發(fā)揮基礎(chǔ)性調(diào)節(jié)作用[5]。因此,如何從EGC角度進(jìn)一步闡明腸I/R損傷機(jī)制,加強(qiáng)小腸IEB損傷保護(hù)是當(dāng)前亟待解決的重要問(wèn)題。腺苷酸A2A受體(adenosine 2a receptor,A2AR)是一類G蛋白偶聯(lián)受體,其與腺苷結(jié)合后激活誘導(dǎo)活化腺苷酸環(huán)化酶,促進(jìn)第二信使c AMP的合成并產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[6]。前期已有研究發(fā)現(xiàn),活化的A2AR可在心、肺、肝等多個(gè)臟器的I/R損傷中發(fā)揮重要的保護(hù)作用:A2AR可通過(guò)調(diào)控多個(gè)炎癥介質(zhì)作用、抑制炎癥反應(yīng)緩解組織損傷[7-10]。A2AR在腸I/R過(guò)程中發(fā)揮何種作用目前仍不清楚,但近年研究提示A2AR在腸道抗炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,提示A2AR在腸I/R損傷進(jìn)程中的潛在保護(hù)作用[11]。本研究利用野生型及A2AR基因敲除小鼠對(duì)比觀察正常及腸I/R模型中腸屏障功能及結(jié)構(gòu)改變,同時(shí)通過(guò)建立EGC與腸上皮細(xì)胞系IEC-6的共培養(yǎng)體系,干預(yù)EGC細(xì)胞A2AR活性來(lái)觀測(cè)其在正常及缺氧再?gòu)?fù)氧(hypoxia reoxygenation,HR)刺激下對(duì)IEC-6屏障功能及中ZO-1表達(dá)變化的影響,進(jìn)一步探討小腸I/R刺激下A2AR在介導(dǎo)EGC調(diào)控IEB中的作用機(jī)制,以期為發(fā)現(xiàn)腸損傷保護(hù)新靶點(diǎn)提供依據(jù)。研究?jī)?nèi)容及方法1.借助EGC-IEC-6細(xì)胞共培養(yǎng)模型及IEC-6細(xì)胞缺氧再?gòu)?fù)氧(HR)模型,通過(guò)給予A2AR激動(dòng)劑或拮抗劑前期干預(yù)EGC細(xì)胞中A2AR活性,利用跨上皮電阻(TER)及Western Blot技術(shù)檢測(cè)IEC-6細(xì)胞屏障功能及緊密連接蛋白ZO-1表達(dá),對(duì)比觀察生理及病理情況下干預(yù)EGC A2AR表達(dá)對(duì)IEC屏障功能的影響。同時(shí)利用q PCR技術(shù)檢測(cè)EGC細(xì)胞內(nèi)IL-1β、TNF-αmRNA變化,探索其分子機(jī)制。2.通過(guò)手術(shù)夾閉腸系膜動(dòng)脈建立小鼠小腸I/R損傷,HE染色技術(shù)對(duì)比觀察A2AR野生型及A2AR敲除(A2AR-/-)小鼠小腸黏膜形態(tài)學(xué)變化,使用Ussing Chamber技術(shù)對(duì)比觀察A2AR野生型及A2AR-/-小鼠腸黏膜通透性變化情況。3.免疫熒光技術(shù)對(duì)比觀察小鼠小腸ZO-1表達(dá)分布變化情況。Western Blot技術(shù)對(duì)比觀察A2AR野生型及A2AR-/-小鼠小腸腸上皮細(xì)胞中ZO-1表達(dá)變化情況。研究結(jié)果1.跨上皮電阻(TER)檢測(cè)及Western blot檢測(cè)腸上皮細(xì)胞ZO-1蛋白變化可以發(fā)現(xiàn),正常條件下與EGC共培養(yǎng)可使IEC-6細(xì)胞中ZO-1蛋白的表達(dá)明顯上調(diào),TER值明顯上升(p0.05);而與之相比,給予EGC細(xì)胞A2AR激動(dòng)劑CGS21680預(yù)處理組可進(jìn)一步促進(jìn)IEC-6細(xì)胞ZO-1蛋白表達(dá)水平及TER值上調(diào)(p0.05)。同時(shí),缺氧再?gòu)?fù)氧(HR)刺激可明顯抑制EGC細(xì)胞對(duì)IEC-6細(xì)胞ZO-1蛋白表達(dá)及TER值的上調(diào)作用(p0.05),而給予A2AR激動(dòng)劑CGS 21680預(yù)處理EGC后可明顯恢復(fù)ZO-1表達(dá)水平及TER值上升,給予A2AR拮抗劑ZM241385處理則使HR的損傷作用進(jìn)一步加強(qiáng)(p0.05)。2.q PCR法檢測(cè)EGC細(xì)胞促炎癥因子表達(dá)發(fā)現(xiàn),與正常組相比,HR條件下IL-1β、TNF-α的mRNA水平明顯上調(diào)(p0.05);與HR組相比,給予A2AR激動(dòng)劑CGS 21680作用EGC后,IL-1β、TNF-α的m RNA水平明顯下調(diào),而給予A2aR拮抗劑ZM241385作用后則IL-1β、TNF-α表達(dá)進(jìn)一步明顯上調(diào)(p0.05)。3.通過(guò)Ussing Chamber系統(tǒng)檢測(cè)小腸上皮通透性發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組和A2AR-/-+假手術(shù)組小腸黏膜上皮通透性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);與假手術(shù)組相比,I/R組與A2AR-/-+I/R組的TER值分別下降了約46%和62%(p0.05);相比I/R組,A2AR-/-+I/R組的TER值也顯著下降(p0.05)。4.小腸HE染色顯示,假手術(shù)組及A2AR-/-+假手術(shù)組小腸黏膜完整、排列整齊、無(wú)明顯水腫,絨毛無(wú)斷裂脫落;與這2組相比,I/R組小腸黏膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破壞,部分絨毛出現(xiàn)水腫、斷裂,而A2AR-/-+I/R組可見(jiàn)小腸黏膜結(jié)構(gòu)明顯紊亂、水腫,絨毛斷裂脫落明顯增多。A2AR-/-+I/R組小腸黏膜結(jié)構(gòu)的破壞程度明顯重于I/R組,提示A2AR基因敲除可加重I/R刺激對(duì)小鼠小腸的結(jié)構(gòu)損傷作用,Chiu評(píng)分也與其趨勢(shì)一致。5.免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn),緊密連接蛋白ZO-1在腸上皮細(xì)胞表面呈線性分布,細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)未見(jiàn)表達(dá)。假手術(shù)組及A2AR-/-+假手術(shù)組中ZO-1熒光呈連續(xù)性表達(dá),且假手術(shù)組熒光強(qiáng)度高于A2AR-/-+假手術(shù)組(p0.05),提示A2AR基因敲除可下調(diào)腸上皮ZO-1表達(dá)。與假手術(shù)組相比,A2AR-/-+I/R組與I/R組ZO-1熒光強(qiáng)度明顯弱化,且A2AR-/-+I/R組的ZO-1熒光強(qiáng)度低于I/R組(p0.05)。6.EGC特異性標(biāo)志物GFAP染色分析顯示,GFAP蛋白主要在腸絨毛內(nèi)部基底層呈點(diǎn)狀分布表達(dá),熒光呈紅色,主要表達(dá)于EGC胞漿內(nèi),與A2AR-/-組相比,A2AR-/-+假手術(shù)組中GFAP蛋白染色明顯增多(p0.05);且相對(duì)于假手術(shù)組,A2AR-/-組中GFAP也明顯增多(p0.05),提示A2AR基因敲除及I/R下EGC細(xì)胞明顯被活化。根據(jù)GFAP及ZO-1雙標(biāo)結(jié)果,提示A2AR在腸I/R損傷中的保護(hù)作用可能與A2AR介導(dǎo)EGC對(duì)腸上皮間緊密連接蛋白ZO-1的調(diào)控有關(guān)。7.提取各組腸上皮細(xì)胞總蛋白,Western blot法檢測(cè)顯示,與假手術(shù)組相比,A2AR-/-+假手術(shù)組ZO-1的表達(dá)明顯下調(diào)(p0.05),進(jìn)一步印證A2AR對(duì)ZO-1的調(diào)控作用;而I/R組ZO-1表達(dá)下降了約47%,A2AR-/-+I/R組ZO-1表達(dá)則下降了60%;并且后2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論1.A2AR參與了EGC與IEC之間的細(xì)胞對(duì)話,EGC可通過(guò)A2AR信號(hào)通路上調(diào)IEC細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)來(lái)保護(hù)IEB功能,抑制H/R刺激對(duì)IEB的損傷作用。2.A2AR基因敲除可明顯加劇急性IR刺激誘導(dǎo)的腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷,IEB損傷加重,同時(shí)伴隨著緊密連接蛋白ZO-1蛋白的表達(dá)顯著下調(diào),提示A2AR蛋白在急性I/R刺激下的IEB功能調(diào)控中發(fā)揮著保護(hù)性作用,A2AR有可能成為IEB功能保護(hù)新的干預(yù)靶點(diǎn)。3.A2AR基因敲除小鼠小腸粘膜內(nèi)EGC標(biāo)志物GFAP蛋白表達(dá)明顯比野生型升高,提示A2AR可能通過(guò)調(diào)節(jié)EGC活性來(lái)參與腸屏障調(diào)控。
[Abstract]:Background Studies have shown that acute intestinal ischemia - reperfusion ( I / R ) injury caused by various large - scale surgery and acute trauma has become one of the most common causes of intestinal epithelial barrier ( IEB ) injury , intestinal failure , and even multiple organ dysfunction . The study shows that EGC plays a key role not only in nutrition support and protection of intestinal neurons , but also plays a basic regulatory role in maintaining the structure and functional stability of IEB . Therefore , how to further elucidate the mechanism of intestinal I / R injury from the angle of EGC and strengthen the protection of IEB in the small intestine is an important problem to be solved urgently . The adenosine A2A receptor ( A2AR ) is a kind of G protein coupled receptor which activates adenylyl cyclase after the combination of adenosine and promotes the synthesis of the second messenger and produces a corresponding biological effect . It has been found that A2AR plays an important role in the I / R injury of heart , lung and liver . A2AR plays an important role in intestinal I / R , but it is suggested that A2AR plays an important role in intestinal anti - inflammatory reaction , and suggests that A2AR plays an important role in intestinal I / R injury . In this study , we observed the changes of intestinal barrier function and structure in normal and intestinal I / R models by using wild - type and A2AR gene knockout mice . Compared with the sham operation group , the expression of ZO - 1 in the intestinal epithelial cells of A2AR - / - + I / R group was significantly lower than that in the sham - operated group .
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R61

【參考文獻(xiàn)】

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1 游揚(yáng);楊歆;常杏;鄧盛瑜;李靜;楊仕明;凌賢龍;;腺苷酸活化蛋白激酶在重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜屏障損傷機(jī)制中的作用[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2016年09期

2 齊國(guó)卿;謝瑞霞;張德奎;;腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在炎癥性腸病發(fā)生發(fā)展中作用的研究進(jìn)展[J];世界華人消化雜志;2014年08期

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本文編號(hào)：1976581