本文選題：腺苷酸A2A受體 + 腸膠質(zhì)細胞�。� 參考：《第三軍醫(yī)大學》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景研究表明,各種大型手術以及急性戰(zhàn)創(chuàng)傷引起的急性小腸缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)損傷已成為臨床常見的誘發(fā)腸黏膜屏障(intestinal epithelial barrier,IEB)損傷、腸衰竭,甚至多器官障礙的重要原因之一[1-3]。作為腸道神經(jīng)系統(tǒng)最豐富的細胞類型,腸膠質(zhì)細胞(enteric glial cell,EGC)已被證實與IEB功能調(diào)控關系密切[4]。研究顯示,EGC不僅在腸神經(jīng)元營養(yǎng)支持和保護方面發(fā)揮著關鍵作用,同時也在保持IEB結構與功能穩(wěn)定性方面發(fā)揮基礎性調(diào)節(jié)作用[5]。因此,如何從EGC角度進一步闡明腸I/R損傷機制,加強小腸IEB損傷保護是當前亟待解決的重要問題。腺苷酸A2A受體(adenosine 2a receptor,A2AR)是一類G蛋白偶聯(lián)受體,其與腺苷結合后激活誘導活化腺苷酸環(huán)化酶,促進第二信使c AMP的合成并產(chǎn)生相應的生物學效應[6]。前期已有研究發(fā)現(xiàn),活化的A2AR可在心、肺、肝等多個臟器的I/R損傷中發(fā)揮重要的保護作用:A2AR可通過調(diào)控多個炎癥介質(zhì)作用、抑制炎癥反應緩解組織損傷[7-10]。A2AR在腸I/R過程中發(fā)揮何種作用目前仍不清楚,但近年研究提示A2AR在腸道抗炎癥反應中發(fā)揮重要作用,提示A2AR在腸I/R損傷進程中的潛在保護作用[11]。本研究利用野生型及A2AR基因敲除小鼠對比觀察正常及腸I/R模型中腸屏障功能及結構改變,同時通過建立EGC與腸上皮細胞系IEC-6的共培養(yǎng)體系,干預EGC細胞A2AR活性來觀測其在正常及缺氧再復氧(hypoxia reoxygenation,HR)刺激下對IEC-6屏障功能及中ZO-1表達變化的影響,進一步探討小腸I/R刺激下A2AR在介導EGC調(diào)控IEB中的作用機制,以期為發(fā)現(xiàn)腸損傷保護新靶點提供依據(jù)。研究內(nèi)容及方法1.借助EGC-IEC-6細胞共培養(yǎng)模型及IEC-6細胞缺氧再復氧(HR)模型,通過給予A2AR激動劑或拮抗劑前期干預EGC細胞中A2AR活性,利用跨上皮電阻(TER)及Western Blot技術檢測IEC-6細胞屏障功能及緊密連接蛋白ZO-1表達,對比觀察生理及病理情況下干預EGC A2AR表達對IEC屏障功能的影響。同時利用q PCR技術檢測EGC細胞內(nèi)IL-1β、TNF-αmRNA變化,探索其分子機制。2.通過手術夾閉腸系膜動脈建立小鼠小腸I/R損傷,HE染色技術對比觀察A2AR野生型及A2AR敲除(A2AR-/-)小鼠小腸黏膜形態(tài)學變化,使用Ussing Chamber技術對比觀察A2AR野生型及A2AR-/-小鼠腸黏膜通透性變化情況。3.免疫熒光技術對比觀察小鼠小腸ZO-1表達分布變化情況。Western Blot技術對比觀察A2AR野生型及A2AR-/-小鼠小腸腸上皮細胞中ZO-1表達變化情況。研究結果1.跨上皮電阻(TER)檢測及Western blot檢測腸上皮細胞ZO-1蛋白變化可以發(fā)現(xiàn),正常條件下與EGC共培養(yǎng)可使IEC-6細胞中ZO-1蛋白的表達明顯上調(diào),TER值明顯上升(p0.05);而與之相比,給予EGC細胞A2AR激動劑CGS21680預處理組可進一步促進IEC-6細胞ZO-1蛋白表達水平及TER值上調(diào)(p0.05)。同時,缺氧再復氧(HR)刺激可明顯抑制EGC細胞對IEC-6細胞ZO-1蛋白表達及TER值的上調(diào)作用(p0.05),而給予A2AR激動劑CGS 21680預處理EGC后可明顯恢復ZO-1表達水平及TER值上升,給予A2AR拮抗劑ZM241385處理則使HR的損傷作用進一步加強(p0.05)。2.q PCR法檢測EGC細胞促炎癥因子表達發(fā)現(xiàn),與正常組相比,HR條件下IL-1β、TNF-α的mRNA水平明顯上調(diào)(p0.05);與HR組相比,給予A2AR激動劑CGS 21680作用EGC后,IL-1β、TNF-α的m RNA水平明顯下調(diào),而給予A2aR拮抗劑ZM241385作用后則IL-1β、TNF-α表達進一步明顯上調(diào)(p0.05)。3.通過Ussing Chamber系統(tǒng)檢測小腸上皮通透性發(fā)現(xiàn),假手術組和A2AR-/-+假手術組小腸黏膜上皮通透性差異無統(tǒng)計學意義(p0.05);與假手術組相比,I/R組與A2AR-/-+I/R組的TER值分別下降了約46%和62%(p0.05);相比I/R組,A2AR-/-+I/R組的TER值也顯著下降(p0.05)。4.小腸HE染色顯示,假手術組及A2AR-/-+假手術組小腸黏膜完整、排列整齊、無明顯水腫,絨毛無斷裂脫落;與這2組相比,I/R組小腸黏膜結構出現(xiàn)破壞,部分絨毛出現(xiàn)水腫、斷裂,而A2AR-/-+I/R組可見小腸黏膜結構明顯紊亂、水腫,絨毛斷裂脫落明顯增多。A2AR-/-+I/R組小腸黏膜結構的破壞程度明顯重于I/R組,提示A2AR基因敲除可加重I/R刺激對小鼠小腸的結構損傷作用,Chiu評分也與其趨勢一致。5.免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn),緊密連接蛋白ZO-1在腸上皮細胞表面呈線性分布,細胞質(zhì)、細胞核內(nèi)未見表達。假手術組及A2AR-/-+假手術組中ZO-1熒光呈連續(xù)性表達,且假手術組熒光強度高于A2AR-/-+假手術組(p0.05),提示A2AR基因敲除可下調(diào)腸上皮ZO-1表達。與假手術組相比,A2AR-/-+I/R組與I/R組ZO-1熒光強度明顯弱化,且A2AR-/-+I/R組的ZO-1熒光強度低于I/R組(p0.05)。6.EGC特異性標志物GFAP染色分析顯示,GFAP蛋白主要在腸絨毛內(nèi)部基底層呈點狀分布表達,熒光呈紅色,主要表達于EGC胞漿內(nèi),與A2AR-/-組相比,A2AR-/-+假手術組中GFAP蛋白染色明顯增多(p0.05);且相對于假手術組,A2AR-/-組中GFAP也明顯增多(p0.05),提示A2AR基因敲除及I/R下EGC細胞明顯被活化。根據(jù)GFAP及ZO-1雙標結果,提示A2AR在腸I/R損傷中的保護作用可能與A2AR介導EGC對腸上皮間緊密連接蛋白ZO-1的調(diào)控有關。7.提取各組腸上皮細胞總蛋白,Western blot法檢測顯示,與假手術組相比,A2AR-/-+假手術組ZO-1的表達明顯下調(diào)(p0.05),進一步印證A2AR對ZO-1的調(diào)控作用;而I/R組ZO-1表達下降了約47%,A2AR-/-+I/R組ZO-1表達則下降了60%;并且后2組比較差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。結論1.A2AR參與了EGC與IEC之間的細胞對話,EGC可通過A2AR信號通路上調(diào)IEC細胞緊密連接蛋白ZO-1表達來保護IEB功能,抑制H/R刺激對IEB的損傷作用。2.A2AR基因敲除可明顯加劇急性IR刺激誘導的腸黏膜結構損傷,IEB損傷加重,同時伴隨著緊密連接蛋白ZO-1蛋白的表達顯著下調(diào),提示A2AR蛋白在急性I/R刺激下的IEB功能調(diào)控中發(fā)揮著保護性作用,A2AR有可能成為IEB功能保護新的干預靶點。3.A2AR基因敲除小鼠小腸粘膜內(nèi)EGC標志物GFAP蛋白表達明顯比野生型升高,提示A2AR可能通過調(diào)節(jié)EGC活性來參與腸屏障調(diào)控。
[Abstract]:Background Studies have shown that acute intestinal ischemia - reperfusion ( I / R ) injury caused by various large - scale surgery and acute trauma has become one of the most common causes of intestinal epithelial barrier ( IEB ) injury , intestinal failure , and even multiple organ dysfunction . The study shows that EGC plays a key role not only in nutrition support and protection of intestinal neurons , but also plays a basic regulatory role in maintaining the structure and functional stability of IEB . Therefore , how to further elucidate the mechanism of intestinal I / R injury from the angle of EGC and strengthen the protection of IEB in the small intestine is an important problem to be solved urgently . The adenosine A2A receptor ( A2AR ) is a kind of G protein coupled receptor which activates adenylyl cyclase after the combination of adenosine and promotes the synthesis of the second messenger and produces a corresponding biological effect . It has been found that A2AR plays an important role in the I / R injury of heart , lung and liver . A2AR plays an important role in intestinal I / R , but it is suggested that A2AR plays an important role in intestinal anti - inflammatory reaction , and suggests that A2AR plays an important role in intestinal I / R injury . In this study , we observed the changes of intestinal barrier function and structure in normal and intestinal I / R models by using wild - type and A2AR gene knockout mice . Compared with the sham operation group , the expression of ZO - 1 in the intestinal epithelial cells of A2AR - / - + I / R group was significantly lower than that in the sham - operated group .
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R61

【參考文獻】

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1 游揚;楊歆;常杏;鄧盛瑜;李靜;楊仕明;凌賢龍;;腺苷酸活化蛋白激酶在重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜屏障損傷機制中的作用[J];第三軍醫(yī)大學學報;2016年09期

2 齊國卿;謝瑞霞;張德奎;;腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞在炎癥性腸病發(fā)生發(fā)展中作用的研究進展[J];世界華人消化雜志;2014年08期

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本文編號：1976581