本文選題：FGFR2 + 衰老��； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：FGFR2屬于四個(gè)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR1-4)家族中的一員,通過(guò)與FGF配體結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)功能。既往研究顯示FGFR2可以影響骨骼發(fā)育,導(dǎo)致包括Apert、Crouzon、Pfeiffer等在內(nèi)的多種顱縫早閉綜合征(craniosynostoses)。兩種FGFR2功能增強(qiáng)(gain-of-function)型點(diǎn)突變(S252W和P253R)可以導(dǎo)致Apert綜合征,主要表現(xiàn)為身材短小,冠狀縫早閉,頭顱圓鈍縮短和顱面畸形。目前關(guān)于Apert綜合征的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚,且仍缺乏有效緩解顱骨畸形的治療藥物,只能靠手術(shù)部分緩解癥狀。探索Apert綜合征發(fā)病分子、細(xì)胞機(jī)制,可望為臨床上綜合應(yīng)用相關(guān)靶向生物技術(shù)、手術(shù)等措施治療Apert綜合征提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。顱縫間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cell,MSCs)是新近研究發(fā)現(xiàn)的,存在于顱縫間充質(zhì)中的一類(lèi)具有多向分化潛能的細(xì)胞。在小鼠顱縫中條件性剔除顱縫MSCs,可導(dǎo)致小鼠頭顱生長(zhǎng)阻滯和顱縫早閉。同時(shí)在Twist1基因半缺失(Twist1+/-)導(dǎo)致的小鼠顱縫早閉模型中,其顱縫MSCs明顯減少。最近研究顯示由Recql4基因突變導(dǎo)致的小鼠早衰模型中,其顱骨發(fā)育畸形,出現(xiàn)顱縫早閉表型。這些研究提示顱縫MSCs衰老可能是FGFR2導(dǎo)致Apert綜合征顱縫早閉的原因,但具體機(jī)制不清楚。自噬在干細(xì)胞自我更新中發(fā)揮重要作用,自噬降低可引起干細(xì)胞衰老。FGFs/FGFRs在自噬調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在小鼠MEF及心臟干細(xì)胞中,FGFR信號(hào)通過(guò)FRS2α引起PI3K/AKT信號(hào)通路激活的激活,導(dǎo)致mTOR的激活,進(jìn)而抑制自噬的活性。我們前期研究發(fā)現(xiàn)FGFs/FGFR3信號(hào)通路負(fù)調(diào)控自噬水平,在軟骨發(fā)育中發(fā)揮重要作用。FGFR2與FGFR3具有高度同源性,提示FGFR2也可能對(duì)自噬具有調(diào)節(jié)作用,但具體機(jī)制不清楚。為了研究自噬和顱縫MSCs衰老在Apert綜合征發(fā)病中的作用,我們基于Cre-Loxp系統(tǒng)建立了Apert小鼠和敲除p16基因的Apert小鼠,綜合應(yīng)用骨骼組織病理和原代細(xì)胞培養(yǎng)等對(duì)比觀察Apert小鼠和p16敲除Apert小鼠頭顱畸形、顱縫早閉、衰老表型及顱縫MSCs的自噬、衰老情況,并深入研究FGFR2對(duì)自噬和衰老的調(diào)控作用,以及自噬和干細(xì)胞衰老在Apert發(fā)生中的作用。FGFR2在成骨細(xì)胞分化和骨形成中發(fā)揮重要作用。但是FGFR2在成年期骨形成和骨重塑中的作用未見(jiàn)報(bào)道。既往研究報(bào)道FGFR2基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人口的股骨頸骨密度相關(guān),同時(shí)Fgfr2突變引起的人類(lèi)骨骼遺傳病的病人中,其四肢骨和顱骨有骨化異常表型。這些研究提示FGFR2參與了成年期骨形成和骨重塑過(guò)程,但具體機(jī)制不清。BMX模型是目前比較公認(rèn)的一種研究骨再生(regeneration)和骨重塑(remodeling)的模型,被廣泛應(yīng)用于研究相關(guān)基因或生長(zhǎng)因子在骨再生和骨重塑中的作用和功能。所以在第二部分實(shí)驗(yàn)中,我們建立了成年期可誘導(dǎo)增強(qiáng)FGFR2-P253R的小鼠,通過(guò)BMX模型,研究FGFR2功能增強(qiáng)對(duì)骨形成和骨重塑的影響,并探討相關(guān)機(jī)制。FGFs/FGFRs在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持及關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。既往我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)在成年期軟骨細(xì)胞條件敲除Fgfr1后,通過(guò)降低MMP13表達(dá),緩解了小鼠老年性及DMM手術(shù)誘導(dǎo)的骨性關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。這些結(jié)果提示FGFR1可能是治療關(guān)節(jié)軟骨退變的新靶點(diǎn),通過(guò)藥物靶向性的抑制FGFR1可以抑制軟骨基質(zhì)降解,延緩關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。所以在第三部分實(shí)驗(yàn)中,我們研究了一種新的FGFR1特異性抑制劑G141,對(duì)由FGF-2或IL-1β引起的人類(lèi)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞或組織塊關(guān)節(jié)退變中的作用和對(duì)小鼠因內(nèi)側(cè)半月板不穩(wěn)定(DMM)導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨退變的影響。研究方法第一部分:FGFR2在Apert綜合征發(fā)病中的作用與機(jī)制研究1.建立Apert小鼠模型,測(cè)量小鼠的體重和體長(zhǎng),利用X線攝片、Micro-CT觀察小鼠大體表型和骨骼變化,通過(guò)HE染色觀察Apert小鼠皮膚表型,通過(guò)western blot觀察小鼠肝、腎和骨組織中p53、p21、p16和γH2AX蛋白水平變化;2.利用衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色觀察顱縫MSCs衰老陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),利用標(biāo)記保留細(xì)胞(Label Retaining Cells)方法,通過(guò)EdU長(zhǎng)時(shí)程標(biāo)記觀察顱縫MSCs細(xì)胞數(shù)目,利用TUNEL染色觀察顱縫MSCs凋亡情況,分離Apert小鼠顱縫MSCs,觀察其克隆形成能力、增殖能力、衰老狀態(tài)及p53、p21、p16和γH2AX蛋白水平表達(dá)變化;3.建立p16-/-;Fgfr2P253R/+雙突變小鼠模型,通過(guò)X線攝片和阿爾新藍(lán)茜素紅全骨架染色觀察,小鼠大體表型變化,通話HE染色觀察顱縫早閉情況;4.建立可反映Apert小鼠自噬狀態(tài)的GFP-LC3;Apert小鼠,組織切片觀察顱縫MSCs自噬變化;分離小鼠顱縫間充質(zhì)細(xì)胞,Western blot觀察LC3水平變化;5.通過(guò)自噬激動(dòng)劑雷帕霉素處理小鼠顱縫MSCs,通過(guò)衰老相關(guān)β-gal染色、免疫熒光、western blot和增殖克隆形成實(shí)驗(yàn)等觀察自噬激活對(duì)顱縫MSCs衰老狀態(tài)的影響;6.利用LysoTracker、MitoTracker和CellROX染料觀察Apert小鼠顱縫MSCs中線粒體、溶酶體和ROS水平變化及雷帕霉素和NAC處理后對(duì)顱縫MSCs ROS水平和衰老的影響。第二部分:FGFR2在BMX后骨形成中的作用與機(jī)制研究1.建立成年期可誘導(dǎo)增強(qiáng)FGFR2小鼠,制作BMX模型;2.通過(guò)Micro-CT和硬組織切片von kossa染色定量觀察BMX后1周、2周和3周股骨和脛骨骨髓腔中骨形成情況;3.利用HE染色和組織形態(tài)計(jì)量統(tǒng)計(jì)BMX后1周、2周和3周新生骨組織中成骨細(xì)胞數(shù)目變化,同時(shí)利用定量PCR檢測(cè)BMX后1周、2周和3周新生骨組織中成骨分化相關(guān)基因Runx2、Col I、Alp、OP和OC的mRNA水平變化;4.利用TRAP染色和組織形態(tài)計(jì)量觀察BMX后1周、2周和3周新生骨組織中破骨細(xì)胞表面積變化,同時(shí)利用定量PCR檢測(cè)BMX后1周、2周和3周新生骨組織Rankl、Opg、M-Csf及Rankl/Opg的比值變化;5.利用EdU標(biāo)記觀察BMX后4天間充質(zhì)細(xì)胞和BMX后1周成骨細(xì)胞增殖情況,采用免疫組化觀察BMX后一周Runx2和OC的表達(dá)水平變化;6.利用免疫組化和western blot檢測(cè)BMX后一周新生骨組織中β-catenin水平變化,同時(shí)利用PCR檢測(cè)BMX后1周新生骨組織中Wnt/β-catenin下游靶基因Tcf1、Lef1、CyclinD1和CD44的mRNA水平變化;7.采用Wnt/β-catenin信號(hào)阻斷劑XAV939腹腔注射BMX后小鼠,通過(guò)免疫組化觀察BMX后一周新生骨組織中β-catenin水平變化,通過(guò)Micro-CT觀察股骨骨髓腔中新生骨組織變化,通過(guò)HE和TRAP染色和組織形態(tài)計(jì)量觀察成骨細(xì)胞數(shù)量和破骨細(xì)胞表面積變化。第三部分:一種新的FGFR1抑制劑對(duì)關(guān)節(jié)炎的治療作用研究1.采用激酶抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)G141對(duì)FGFR1、VEGFR2、PDGFRβ、FGFR2和FGFR3的抑制作用,確定其半抑制濃度(IC50),采用caliper mobility shift assay檢測(cè)G141與ATP的競(jìng)爭(zhēng)性關(guān)系;2.分離人類(lèi)原代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,采用FGF-2和G141處理后,通過(guò)western blot檢測(cè)MMP13和ADAMTS5的蛋白表達(dá)變化,通過(guò)定量PCR檢測(cè)Mmp13、Adamts5、Type II collagen和Aggrecan的mRNA表達(dá)水平變化;3.采用IL-1β和G141處理人類(lèi)原代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞后,通過(guò)定量PCR檢測(cè)Mmp13、Adamts5、Type II collagen和Aggrecan的mRNA表達(dá)水平變化,通過(guò)western blot檢測(cè)MMP13和JNK、ERK1/2和p38 MAPK信號(hào)通路變化;4.體外培養(yǎng)人類(lèi)股骨頭軟骨組織塊,加入FGF-2和或G141共培養(yǎng)14天,，

本文編號(hào)：1965647