本文選題：FGFR2 + 衰老��； 參考：《第三軍醫(yī)大學》2017年博士論文

【摘要】：FGFR2屬于四個成纖維細胞生長因子受體(FGFR1-4)家族中的一員,通過與FGF配體結合發(fā)揮其生物學功能。既往研究顯示FGFR2可以影響骨骼發(fā)育,導致包括Apert、Crouzon、Pfeiffer等在內(nèi)的多種顱縫早閉綜合征(craniosynostoses)。兩種FGFR2功能增強(gain-of-function)型點突變(S252W和P253R)可以導致Apert綜合征,主要表現(xiàn)為身材短小,冠狀縫早閉,頭顱圓鈍縮短和顱面畸形。目前關于Apert綜合征的發(fā)病機制仍不完全清楚,且仍缺乏有效緩解顱骨畸形的治療藥物,只能靠手術部分緩解癥狀。探索Apert綜合征發(fā)病分子、細胞機制,可望為臨床上綜合應用相關靶向生物技術、手術等措施治療Apert綜合征提供初步實驗依據(jù)。顱縫間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cell,MSCs)是新近研究發(fā)現(xiàn)的,存在于顱縫間充質中的一類具有多向分化潛能的細胞。在小鼠顱縫中條件性剔除顱縫MSCs,可導致小鼠頭顱生長阻滯和顱縫早閉。同時在Twist1基因半缺失(Twist1+/-)導致的小鼠顱縫早閉模型中,其顱縫MSCs明顯減少。最近研究顯示由Recql4基因突變導致的小鼠早衰模型中,其顱骨發(fā)育畸形,出現(xiàn)顱縫早閉表型。這些研究提示顱縫MSCs衰老可能是FGFR2導致Apert綜合征顱縫早閉的原因,但具體機制不清楚。自噬在干細胞自我更新中發(fā)揮重要作用,自噬降低可引起干細胞衰老。FGFs/FGFRs在自噬調控中發(fā)揮重要作用。在小鼠MEF及心臟干細胞中,FGFR信號通過FRS2α引起PI3K/AKT信號通路激活的激活,導致mTOR的激活,進而抑制自噬的活性。我們前期研究發(fā)現(xiàn)FGFs/FGFR3信號通路負調控自噬水平,在軟骨發(fā)育中發(fā)揮重要作用。FGFR2與FGFR3具有高度同源性,提示FGFR2也可能對自噬具有調節(jié)作用,但具體機制不清楚。為了研究自噬和顱縫MSCs衰老在Apert綜合征發(fā)病中的作用,我們基于Cre-Loxp系統(tǒng)建立了Apert小鼠和敲除p16基因的Apert小鼠,綜合應用骨骼組織病理和原代細胞培養(yǎng)等對比觀察Apert小鼠和p16敲除Apert小鼠頭顱畸形、顱縫早閉、衰老表型及顱縫MSCs的自噬、衰老情況,并深入研究FGFR2對自噬和衰老的調控作用,以及自噬和干細胞衰老在Apert發(fā)生中的作用。FGFR2在成骨細胞分化和骨形成中發(fā)揮重要作用。但是FGFR2在成年期骨形成和骨重塑中的作用未見報道。既往研究報道FGFR2基因多態(tài)性與中國漢族人口的股骨頸骨密度相關,同時Fgfr2突變引起的人類骨骼遺傳病的病人中,其四肢骨和顱骨有骨化異常表型。這些研究提示FGFR2參與了成年期骨形成和骨重塑過程,但具體機制不清。BMX模型是目前比較公認的一種研究骨再生(regeneration)和骨重塑(remodeling)的模型,被廣泛應用于研究相關基因或生長因子在骨再生和骨重塑中的作用和功能。所以在第二部分實驗中,我們建立了成年期可誘導增強FGFR2-P253R的小鼠,通過BMX模型,研究FGFR2功能增強對骨形成和骨重塑的影響,并探討相關機制。FGFs/FGFRs在關節(jié)軟骨細胞穩(wěn)態(tài)維持及關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。既往我們實驗室發(fā)現(xiàn)在成年期軟骨細胞條件敲除Fgfr1后,通過降低MMP13表達,緩解了小鼠老年性及DMM手術誘導的骨性關節(jié)炎進展。這些結果提示FGFR1可能是治療關節(jié)軟骨退變的新靶點,通過藥物靶向性的抑制FGFR1可以抑制軟骨基質降解,延緩關節(jié)炎進展。所以在第三部分實驗中,我們研究了一種新的FGFR1特異性抑制劑G141,對由FGF-2或IL-1β引起的人類關節(jié)軟骨細胞或組織塊關節(jié)退變中的作用和對小鼠因內(nèi)側半月板不穩(wěn)定(DMM)導致的關節(jié)軟骨退變的影響。研究方法第一部分:FGFR2在Apert綜合征發(fā)病中的作用與機制研究1.建立Apert小鼠模型,測量小鼠的體重和體長,利用X線攝片、Micro-CT觀察小鼠大體表型和骨骼變化,通過HE染色觀察Apert小鼠皮膚表型,通過western blot觀察小鼠肝、腎和骨組織中p53、p21、p16和γH2AX蛋白水平變化;2.利用衰老相關β-半乳糖苷酶染色觀察顱縫MSCs衰老陽性細胞數(shù),利用標記保留細胞(Label Retaining Cells)方法,通過EdU長時程標記觀察顱縫MSCs細胞數(shù)目,利用TUNEL染色觀察顱縫MSCs凋亡情況,分離Apert小鼠顱縫MSCs,觀察其克隆形成能力、增殖能力、衰老狀態(tài)及p53、p21、p16和γH2AX蛋白水平表達變化;3.建立p16-/-;Fgfr2P253R/+雙突變小鼠模型,通過X線攝片和阿爾新藍茜素紅全骨架染色觀察,小鼠大體表型變化,通話HE染色觀察顱縫早閉情況;4.建立可反映Apert小鼠自噬狀態(tài)的GFP-LC3;Apert小鼠,組織切片觀察顱縫MSCs自噬變化;分離小鼠顱縫間充質細胞,Western blot觀察LC3水平變化;5.通過自噬激動劑雷帕霉素處理小鼠顱縫MSCs,通過衰老相關β-gal染色、免疫熒光、western blot和增殖克隆形成實驗等觀察自噬激活對顱縫MSCs衰老狀態(tài)的影響;6.利用LysoTracker、MitoTracker和CellROX染料觀察Apert小鼠顱縫MSCs中線粒體、溶酶體和ROS水平變化及雷帕霉素和NAC處理后對顱縫MSCs ROS水平和衰老的影響。第二部分:FGFR2在BMX后骨形成中的作用與機制研究1.建立成年期可誘導增強FGFR2小鼠,制作BMX模型;2.通過Micro-CT和硬組織切片von kossa染色定量觀察BMX后1周、2周和3周股骨和脛骨骨髓腔中骨形成情況;3.利用HE染色和組織形態(tài)計量統(tǒng)計BMX后1周、2周和3周新生骨組織中成骨細胞數(shù)目變化,同時利用定量PCR檢測BMX后1周、2周和3周新生骨組織中成骨分化相關基因Runx2、Col I、Alp、OP和OC的mRNA水平變化;4.利用TRAP染色和組織形態(tài)計量觀察BMX后1周、2周和3周新生骨組織中破骨細胞表面積變化,同時利用定量PCR檢測BMX后1周、2周和3周新生骨組織Rankl、Opg、M-Csf及Rankl/Opg的比值變化;5.利用EdU標記觀察BMX后4天間充質細胞和BMX后1周成骨細胞增殖情況,采用免疫組化觀察BMX后一周Runx2和OC的表達水平變化;6.利用免疫組化和western blot檢測BMX后一周新生骨組織中β-catenin水平變化,同時利用PCR檢測BMX后1周新生骨組織中Wnt/β-catenin下游靶基因Tcf1、Lef1、CyclinD1和CD44的mRNA水平變化;7.采用Wnt/β-catenin信號阻斷劑XAV939腹腔注射BMX后小鼠,通過免疫組化觀察BMX后一周新生骨組織中β-catenin水平變化,通過Micro-CT觀察股骨骨髓腔中新生骨組織變化,通過HE和TRAP染色和組織形態(tài)計量觀察成骨細胞數(shù)量和破骨細胞表面積變化。第三部分:一種新的FGFR1抑制劑對關節(jié)炎的治療作用研究1.采用激酶抑制實驗檢測G141對FGFR1、VEGFR2、PDGFRβ、FGFR2和FGFR3的抑制作用,確定其半抑制濃度(IC50),采用caliper mobility shift assay檢測G141與ATP的競爭性關系;2.分離人類原代關節(jié)軟骨細胞,采用FGF-2和G141處理后,通過western blot檢測MMP13和ADAMTS5的蛋白表達變化,通過定量PCR檢測Mmp13、Adamts5、Type II collagen和Aggrecan的mRNA表達水平變化;3.采用IL-1β和G141處理人類原代關節(jié)軟骨細胞后,通過定量PCR檢測Mmp13、Adamts5、Type II collagen和Aggrecan的mRNA表達水平變化,通過western blot檢測MMP13和JNK、ERK1/2和p38 MAPK信號通路變化;4.體外培養(yǎng)人類股骨頭軟骨組織塊,加入FGF-2和或G141共培養(yǎng)14天,，

本文編號：1965647