發(fā)布時(shí)間：2018-05-27 14:22

  本文選題：TRAIL + U2OS細(xì)胞��； 參考：《昆明理工大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：腫瘤凋亡因子TRAIL是TNF家族的成員之一,其不論在體內(nèi)還是體外均可選擇性的誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,初期臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)TRAIL或死亡受體激動(dòng)劑抗體在癌癥治療中的安全性。另外,也有研究表明許多癌細(xì)胞對(duì)TRAIL有耐受性,究其原因是凋亡通路中抗凋亡蛋白c-FLIP和IAPs等的阻遏。近來研究發(fā)現(xiàn),siRNA靶向抑制c-FLIP的同時(shí)結(jié)合廣譜IAP拮抗劑AT406進(jìn)一步提高了TRAIL誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡,因此聯(lián)合使用c-FLIP抑制劑或拮抗劑、IAP拮抗劑以及TRAIL或死亡受體激動(dòng)劑抗體這三類藥物可能是理想的抗癌新方法。骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤,主要發(fā)生在青少年患者中,它是一種快速生長(zhǎng)且容易轉(zhuǎn)移的腫瘤。骨肉瘤的形成和發(fā)展機(jī)制已經(jīng)研究了很長(zhǎng)一段時(shí)間,最近,更多的研究證據(jù)表明,c-FLIP在調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)中扮演著重要角色。因此,為了利用RNAi技術(shù)來研究c-FLIP在TRAIL誘導(dǎo)的U20S細(xì)胞凋亡中的作用,我們進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)：目的：建立穩(wěn)定下調(diào)c-FLIP表達(dá)的骨肉瘤U20S細(xì)胞系,了解惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的生物特性和耐藥機(jī)制。方法：通過構(gòu)建產(chǎn)生siRNA的質(zhì)粒pSUPER-c-FLIP-siRNA,并將該質(zhì)粒和空載轉(zhuǎn)染入骨肉瘤U20S細(xì)胞系,加入含終濃度為1μg/ml的Puromycin的DMEM培養(yǎng)基篩選6天,加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng),待細(xì)胞密度達(dá)到50%時(shí),繼續(xù)加入維持濃度0.25μg/ml的Puromycin繼續(xù)培養(yǎng),至篩選出穩(wěn)定下調(diào)c-FLIP表達(dá)的克隆細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)。篩選過程中用普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞死亡和生長(zhǎng)狀況。分別應(yīng)用Western Blot和半定量RT-PCR方法比較實(shí)驗(yàn)組克隆細(xì)胞和對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載的克隆細(xì)胞系中c-FLIP蛋白和mRNA水平上的差異。利用MTT方法,檢測(cè)克隆細(xì)胞系U2OS/pSUPER-c-FLIP-siRNA和對(duì)照組U2OS/pSUPER的細(xì)胞凋亡率,c-FLIP抑制劑rocaglamide預(yù)處理4h或沒有預(yù)處理并結(jié)合IAPs抑制劑AT406和TRAIL作用24小時(shí),進(jìn)一步檢驗(yàn)細(xì)胞凋亡,并繪制細(xì)胞的存活率曲線。最后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡全過程,利用SPSSvl9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：我們構(gòu)建了pSUPER-c-FLIP-siRNA質(zhì)粒,然后轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)20S細(xì)胞,之后從這些轉(zhuǎn)染細(xì)胞中篩選得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株U20S/pSUPER-c-FLIP-siRNA和U20S/pSUPER。半定量RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示,與對(duì)照細(xì)胞U2OS/pSUPER相比,克隆細(xì)胞U2OS/pSUPER-c-FLIP-siRNA的c-FLIP表達(dá)被c-FLIP-siRNA顯著抑制。同時(shí),MTT檢測(cè)結(jié)果表明,TRAIL誘導(dǎo)的U20S/pSUPER-c-FLIP-siRNA細(xì)胞凋亡無(wú)論有無(wú)AT406處理均比對(duì)照組U2OS/pSUPER的細(xì)胞凋亡率有所增加。流式細(xì)胞術(shù)表明TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是經(jīng)過細(xì)胞凋亡一系列過程的。然而,Rocaglamide作用下,在兩種細(xì)胞中,TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞死亡都很明顯且死亡率大體相同,表明c-FLIP-siRNA與Rocaglamide的作用機(jī)制是完全相同的。結(jié)論：通過利用c-FLIP-siRNA或Rocaglamide抑制c-FLIP表達(dá)均可增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的U20S細(xì)胞凋亡,表明抑制c-FLIP表達(dá)是癌癥治療的一個(gè)靶標(biāo)。
[Abstract]:In order to study the effect of c - FLIP on TRAIL - induced apoptosis in tumor cells , it was found that the expression of c - FLIP combined with broad - spectrum IAP antagonist AT406 increased the apoptosis of TRAIL - induced cancer cells . indicating that inhibition of c - FLIP expression is a target for cancer treatment .
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R738.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 杜亞平;張澤富;忽景泰;吳懷敏;謝建軍;;RNAi靶向沉默c-FLIP(L)基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞凋亡的影響[J];大家健康(學(xué)術(shù)版);2013年13期

2 張寬仁;張繼虹;沈悅海;彭瓊;范應(yīng)仙;;凋亡因子(TRAIL)對(duì)癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究[J];昆明理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2012年01期

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本文編號(hào)：1942455