本文選題：CREB + CRTC1��； 參考：《南京大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：研究背景:大量臨床調(diào)查顯示,慢性疼痛普遍存在晝夜節(jié)律性改變,且大多表現(xiàn)出夜間的疼痛高峰。晝夜節(jié)律依賴內(nèi)在的生物鐘發(fā)揮作用,生物鐘基因通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄及編碼的蛋白質(zhì)組成鐘振蕩器,維持內(nèi)源性生物鐘的運(yùn)作。下丘腦視交叉上核作為生物鐘中樞控制器,可調(diào)控其他節(jié)律振蕩器來(lái)協(xié)調(diào)機(jī)體的各種生理活動(dòng)和行為過(guò)程。參與疼痛信號(hào)調(diào)制的脊髓背角鐘基因可關(guān)聯(lián)至痛行為的節(jié)律改變。脊髓背角傷害性感受神經(jīng)元的敏化過(guò)程被認(rèn)為參與到疼痛的各環(huán)節(jié),NR2B受體在中樞敏化的誘發(fā)和維持中至關(guān)重要,并可作用于下游信號(hào)分子CRTC1及CREB,CRTC1作為CREB的共激活分子可級(jí)聯(lián)放大CREB的磷酸化表達(dá),參與疼痛的形成和維持。近期研究亦提示NR2B-CRTC1-CREB信號(hào)通路亦與視交叉上核所介導(dǎo)的晝夜節(jié)律有直接關(guān)聯(lián),其與神經(jīng)病理性疼痛節(jié)律性變化的機(jī)制聯(lián)系值得探討。研究目的:1、探索正常晝夜節(jié)律下脊髓背角與中樞控制器的鐘基因表達(dá)關(guān)聯(lián)性,觀察神經(jīng)病理性痛下脊髓背角鐘基因節(jié)律及"睡眠-覺(jué)醒"節(jié)律的改變;2、明確神經(jīng)病理性疼痛痛覺(jué)敏化行為的節(jié)律改變;3、揭示NR2B-CRTC1-CREB信號(hào)通路在谷氨酸誘導(dǎo)的體外原代培養(yǎng)小鼠脊髓神經(jīng)元中的機(jī)制聯(lián)系;4、探討以NR2B-CRTC1-CREB信號(hào)通路與神經(jīng)病理性疼痛節(jié)律的機(jī)制關(guān)聯(lián)為切入點(diǎn)的臨床慢性疼痛診療新思路。研究方法:建立小鼠及大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎模型(Chronic Constriction Injury,CCI)模擬神經(jīng)病理性疼痛;谷氨酸刺激原代培養(yǎng)小鼠脊髓神經(jīng)元體外模擬疼痛發(fā)生,并激活CREB信號(hào)通路;制備CREB及CRTC1干擾腺病毒載體,在疼痛穩(wěn)定期晝夜交替點(diǎn)使用其進(jìn)行干預(yù),觀察疼痛行為學(xué)及NR2B-CRTC1-CREB信號(hào)通路改變;機(jī)械縮足閾值及熱輻射潛伏期測(cè)定評(píng)估小鼠及大鼠痛覺(jué)敏化行為;Minimitter全程實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠"睡眠-覺(jué)醒"節(jié)律相關(guān)的粗大運(yùn)動(dòng)改變;CCK-8檢測(cè)藥物干預(yù)對(duì)神經(jīng)元的殺傷情況;通過(guò)免疫熒光、Western Blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等分子生物學(xué)手段探討相關(guān)的分子機(jī)制改變。研究結(jié)果:1、正常晝夜節(jié)律下小鼠脊髓背角及外周血單個(gè)核細(xì)胞的生物鐘基因Cry1、Per2、Bmal1及Clock的mRNA表達(dá)與位于下丘腦視交叉上核區(qū)的中樞節(jié)律振蕩器呈現(xiàn)相對(duì)同步性,坐骨神經(jīng)結(jié)扎模型小鼠痛覺(jué)穩(wěn)定期脊髓背角鐘基因的表達(dá)具有明顯節(jié)律性振蕩。2、坐骨神經(jīng)結(jié)扎模型小鼠"睡眠-覺(jué)醒"節(jié)律未受影響;相對(duì)睡眠期粗大運(yùn)動(dòng)較假手術(shù)組顯著減少。3、坐骨神經(jīng)痛動(dòng)物機(jī)械縮足閾值與熱輻射潛伏期呈現(xiàn)夜高晝低的節(jié)律性改變。4、體外原代培養(yǎng)的小鼠脊髓神經(jīng)元在谷氨酸最適濃度100μM刺激下,可磷酸化NR2B及CREB;使用CRTC1及CREB干擾腺病毒載體可明顯抑制相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。5、脊髓背角NR2B、CRTC1及CREB的mRNA、活化狀態(tài)的免疫熒光及蛋白水平改變均與坐骨神經(jīng)結(jié)扎小鼠疼痛節(jié)律呈高度一致。6、抑制CRTC1及CREB可明顯減少痛敏行為發(fā)生;在疼痛閾值低谷前的晝夜交替點(diǎn)給予干預(yù)可更有效調(diào)節(jié)疼痛節(jié)律;NR2B-CRTC1-CREB反饋性調(diào)節(jié)信號(hào)通路與痛行為改善具明顯相關(guān)性。研究結(jié)論:1、小鼠脊髓背角生物鐘基因表達(dá)的晝夜節(jié)律與中樞振蕩器呈現(xiàn)相對(duì)同步性,神經(jīng)病理性疼痛下脊髓背角鐘基因可節(jié)律性振蕩。2、神經(jīng)病理性疼痛下可呈現(xiàn)以夜間痛為特點(diǎn)的疼痛節(jié)律,"睡眠-覺(jué)醒"節(jié)律未受影響。3、調(diào)控NR2B-CRTC1-CREB信號(hào)通路可直接影響神經(jīng)病理性疼痛節(jié)律,并改善痛覺(jué)敏化。
[Abstract]:Background: a large number of clinical studies have shown that chronic pain is generally circadian rhythmic changes, and most of them show nocturnal peak of pain. The circadian rhythm relies on the internal clock to play a role. The clock gene makes the clock oscillator through gene transcription and encoded protein to maintain the operation of endogenous circadian clock. The hypothalamic optic cross has been maintained. The upper nucleus, as the central controller of the biological clock, regulates the other rhythmic oscillators to coordinate the physiological and behavioral processes of the body. The spinal dorsal horn clock genes involved in the pain signal modulation can be associated with the rhythmic changes in the pain behavior. The sensitization of the nociceptive neurons in the dorsal horn of the spinal cord is considered to be involved in all aspects of the pain, and NR2B is affected. Body plays an important role in the induction and maintenance of central sensitization, and can act on the downstream signal molecules CRTC1 and CREB. As a co activator of CREB, CRTC1 can cascade to amplify the phosphorylation of CREB and participate in the formation and maintenance of pain. Recent studies also suggest that the NR2B-CRTC1-CREB signaling pathway is also directly related to the circadian rhythm mediated by the suprachiasmatic nucleus. The relationship between the neuropathic pain and the rhythmic changes of neuropathic pain should be discussed. 1. To explore the correlation between the dorsal horn of the spinal cord and the central controller's clock gene expression under normal circadian rhythm, to observe the changes of the genetic rhythm of the spinal dorsal horn and the "sleep awakening" rhythm under the neuropathic pain, and 2, to clarify the neuropathic pain. The rhythmic changes of pain sensitized behavior; 3, reveal the mechanism of NR2B-CRTC1-CREB signaling pathway in the primary cultured mouse spinal cord neurons induced by glutamic acid; 4, explore a new approach to clinical chronic pain diagnosis and treatment with the mechanism of NR2B-CRTC1-CREB signaling pathway and the mechanism of neuropathic pain rhythm. Chronic Constriction Injury (CCI) simulated neuropathic pain in mice and rats; glutamic acid stimulated the primary cultured mouse spinal neurons to simulate pain in vitro, and activated the CREB signaling pathway; the CREB and CRTC1 interfering adenovirus vectors were prepared and used to intervene in the day and night alternation points of the pain stable period. Observe pain behavior and change of NR2B-CRTC1-CREB signal pathway; measure the threshold of mechanical contraction and latent period of heat radiation to evaluate the pain sensitization behavior of mice and rats; Minimitter monitoring the gross motor change related to the "sleep awakening" rhythm of mice in real time; CCK-8 detection of the killing of neurons by drug preconditioning; by immunofluorescence, Wester Molecular biological means such as n Blot and real time fluorescence quantitative PCR are discussed. The results are as follows: 1, the mRNA expression of the clock gene Cry1, Per2, Bmal1 and Clock in the spinal dorsal horn and peripheral blood mononuclear cells of mice under normal circadian rhythm is relative to the central rhythmic oscillator located in the supramoral nucleus of the hypothalamus. The expression of the dorsal horn clock gene in the spinal cord of the mice with the sciatic nerve ligature has an obvious rhythmic oscillation.2, and the sleep awakening rhythm of the sciatic nerve ligature model mice is not affected; the relative sleep period is significantly reduced by.3 in the relative sleep period than in the sham operation group, and the threshold of the mechanical contraction of the sciatic deity pain and the latent period of the thermal radiation exposure are presented. The rhythmic change of night high day low.4, the primary cultured mouse spinal cord neurons were phosphorylated NR2B and CREB under the optimum concentration of glutamic acid 100 micron M. CRTC1 and CREB interfering adenovirus vector could obviously inhibit the mRNA expression.5 of the related genes, NR2B, CRTC1 and CREB mRNA, activated immunofluorescence and protein water in the spinal dorsal horn. The pain rhythm of the sciatic nerve ligation mice was highly consistent with.6, and the inhibition of CRTC1 and CREB could significantly reduce the occurrence of pain sensitization; the intervention of day and night alternation points before the threshold of the pain threshold could be more effective in regulating the pain rhythm; the NR2B-CRTC1-CREB feedback regulation signal pathway was significantly correlated with the improvement of pain behavior. 1 The circadian rhythm of the circadian clock gene expression in the spinal dorsal horn of the mouse is relative synchrony with the central oscillator, and the spinal dorsal horn clock gene can oscillate rhythmically under neuropathic pain, and the pain rhythms characterized by nocturnal pain can be presented under neuropathic pain. The "sleep wake" rhythm is not affected by.3 and regulates the NR2B-CRTC1-CREB signal. Lu can directly affect the rhythm of neuropathic pain and improve pain sensitization.
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R614

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本文編號(hào)：1928594