本文選題：間充質(zhì)干細(xì)胞 + SDF-1��； 參考：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：[研究背景及目的]臨床上因多種原因造成的人體骨組織缺損,是目前臨床醫(yī)學(xué)急需解決的難題之一。移植材料與骨缺損范圍之間的供求矛盾是需要面對(duì)的難點(diǎn)。因此,構(gòu)建組織相容性好,無排異反應(yīng),血管化良好的組織工程骨,是組織工程骨研究的關(guān)鍵。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)具有多向分化潛能,在不同誘導(dǎo)條件下,能向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等中胚層及外胚層組織分化,因此,干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,特別在于修復(fù)和替代病變細(xì)胞、組織及器官等方面起到了重要的作用�；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1, SDF-1)是目前已知的對(duì)干細(xì)胞有明顯趨化作用的因子。SDF-1復(fù)合部分脫蛋白生物骨構(gòu)建的組織工程骨是否可促進(jìn)干細(xì)胞的趨化,進(jìn)而促進(jìn)局部骨缺損愈合,目前尚無研究以證明。因此,我們將SDF-1因子復(fù)合于部分脫蛋白骨上,構(gòu)建SDF-1復(fù)合部分脫蛋白生物骨,并通過生物活體成像技術(shù),以了解體外及活體內(nèi)SDF-1復(fù)合部分脫蛋白生物骨對(duì)干細(xì)胞的趨化作用。以為解決骨移植材料緊缺而提供一條有效的途徑。[方法](1)通過構(gòu)建表達(dá)熒光素酶的慢病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞系C3H10T1/2細(xì)胞,Western blotting檢測(cè)慢病毒感染的C3H10T1/2細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá),將重組pLVX-IRES-Puro-Luciferase病毒感染的C3H10T1/2細(xì)胞用免疫熒光檢測(cè)FLAG的表達(dá)以檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。并將穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2-luci移植于C3H小鼠,經(jīng)注射底物后XENOGEN活體生物發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)。(2)制造小鼠骨缺損模型,并在不同時(shí)相檢測(cè)局部SDF-1的表達(dá),以了解骨缺損后局部SDF-1分泌動(dòng)態(tài)變化的過程。(3)通過體外遷移小室模型,研究不同濃度的SDF-1對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞遷移的影響。(4)將SDF-1復(fù)合于部分脫蛋白生物骨(partially deproteinised biological bone, PDPBB)上構(gòu)建組織工程生物骨。并檢測(cè)SDF-1復(fù)合PDPBB對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞趨化作用的影響,同時(shí)將SDF-1復(fù)合PDPBB植入小鼠體內(nèi),進(jìn)行活體成像,術(shù)后X線攝片及HE切片檢查,了解其在活體內(nèi)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞趨化作用的影響及其在體內(nèi)的耐受性。[結(jié)果](1)慢病毒表達(dá)載體pLenti-TRIM69的酶切鑒定和測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與已知的熒光素酶序列完全一致,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將得到的耐藥細(xì)胞株細(xì)胞用Western blotting檢測(cè)FLAG的表達(dá),結(jié)果顯示此細(xì)胞表達(dá)的蛋白大小與預(yù)期相符(約60KD),表明感染病毒的C3H10T1/2細(xì)胞表達(dá)熒光素酶蛋白。將重組pLVX-IRES-Puro-Luciferase病毒感染的C3H10T1/2細(xì)胞用免疫熒光檢測(cè)FLAG的表達(dá),結(jié)果顯示,與未感染病毒的正常對(duì)照組相比,感染病毒的細(xì)胞組約100%細(xì)胞紅色熒光呈陽性。表明已經(jīng)構(gòu)建好穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的C3H10T1/2細(xì)胞。與C3H10T1/2對(duì)照組相比,熒光素酶基因轉(zhuǎn)染的C3H10T1/2-luci組熒光素酶活性明顯升高,并呈現(xiàn)出良好的倍數(shù)關(guān)系。穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的間充質(zhì)干細(xì)胞移植于C3H小鼠,XENOGEN活體成像系統(tǒng)可檢測(cè)到熒光信號(hào),信號(hào)強(qiáng)度與植入細(xì)胞數(shù)量相關(guān),說明熒光素酶表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建成功。(2)動(dòng)物生存情況,除一只在術(shù)中死亡外,其余動(dòng)物均術(shù)后存活,進(jìn)食活動(dòng)正常,未出現(xiàn)傷口感染情況。免疫組織化學(xué)法的結(jié)果。骨缺損模型建立后SDF-1表達(dá)明顯增高,在不同時(shí)間點(diǎn)均有較高表達(dá),向較健康無骨缺損側(cè)表達(dá)增高。二者之間差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)與陰性對(duì)照組相比,50ng/ml的SDF-1即可有效地引發(fā)C3H10T1/2細(xì)胞的遷移；但200ng/ml與400ng/ml不同濃度的SDF-1所引發(fā)的遷移效應(yīng)并無明顯差異。(4)與部分脫蛋白骨相比,經(jīng)SDF-1(200ng/ml)處理后的PDPBB對(duì)C3H10T1/2-luci細(xì)胞具有一定的趨化作用,并呈現(xiàn)較好的時(shí)效關(guān)系(p0.01)。C3H10T1/2-luci細(xì)胞于術(shù)后當(dāng)天分別注射于SDF-1復(fù)合PDPBB組,部分脫蛋白骨組,單純骨缺損組C3H小鼠,注射部位為右下腹部皮下,經(jīng)注射底物后XENOGEN活體成像系統(tǒng)檢測(cè)。注射后當(dāng)天,三組注射局部可見明顯的熒光信號(hào)。術(shù)后第2天,SDF-1復(fù)合部分脫蛋白生物組小鼠局部可見熒光信號(hào)向右側(cè)股骨手術(shù)部位遷移趨勢(shì)。三組小鼠局部注射后的第4天熒光信號(hào)逐漸減弱,移植后2周局部均不能檢測(cè)到熒光信號(hào)。于術(shù)后第4,6,8周處死小鼠,去除肌肉及周圍組織,取右側(cè)股骨。行X線攝片,了解局部成骨情況。并行H-E切片觀察局部成骨情況�？梢奡DF-1復(fù)合部分脫蛋白生物骨植入后局部骨缺損部分可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),并可見SDF-1復(fù)合部分脫蛋白生物骨逐漸被周圍組織浸潤(rùn)及吸收。術(shù)后4周,X線攝片可見SDF-1復(fù)合PDPBB組,部分脫蛋白骨組股骨缺損局部可見生物骨植入,3組股骨缺損周圍均可見不連續(xù)的纖維骨痂生成。術(shù)后6周,X線攝片可見SDF-1復(fù)合PDPBB組股骨缺損局部可見連續(xù)的骨性骨痂生成。部分脫蛋白骨組,單純骨缺損組骨性骨痂不連續(xù)。術(shù)后8周,X線攝片可見SDF-1復(fù)合PDPBB組股骨缺損局部可見連續(xù)的骨性骨痂生成,骨皮質(zhì)連續(xù),局部愈合良好。部分脫蛋白骨組骨皮質(zhì)模糊,單純骨缺損組欠連續(xù)。SDF-1復(fù)合PDPBB組X線下觀察愈合較部分脫蛋白骨組,單純骨缺損組快。提示SDF-1復(fù)合PDPBB植入后可促進(jìn)局部骨缺損愈合,組織相容性好,無明顯不良反應(yīng)。[結(jié)論](1)獲得熒光素酶穩(wěn)定表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞系C3H10T1/2-luci。轉(zhuǎn)染效果確切,熒光素酶基因表達(dá)穩(wěn)定。為下一步研究提供了穩(wěn)定的示蹤細(xì)胞。(2)成功構(gòu)建了小鼠股骨缺損模型,安全有效,可重復(fù)性好。在骨缺損修復(fù)過程的各時(shí)相點(diǎn),SDF-1均有較高的表達(dá)量。(3)SDF-1在體外對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞系C3H10T1/2細(xì)胞有明顯的濃度依賴性趨化作用。在一定濃度內(nèi),SDF-1對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞的趨化作用呈正相關(guān),而過高濃度的SDF-1并不能無限度提高對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞的趨化能力。(4)本課題中制備的部分脫蛋白骨來源豐富、制作要求低、難度小、費(fèi)用低,SDF-1復(fù)合PDPBB對(duì)C3H10T1/2-luci細(xì)胞具有較強(qiáng)的趨化作用。活體生物成像檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SDF-1復(fù)合PDPBB對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞有一定的趨化作用。該項(xiàng)研究技術(shù)成熟穩(wěn)定,效果良好。
[Abstract]:Objective To investigate the effects of SDF - 1 on bone graft in vitro and in vivo . The effect of SDF - 1 compound PDPBB on the localization of C3H10T1 / 2 cells was detected by Western blotting .
The results showed that SDF - 1 combined with PDPBB had no obvious difference in bone callus formation . After 6 weeks of operation , it was found that SDF - 1 combined with PDPBB had no obvious effect on local bone defects .

【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R687;R318.08

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 廖新根;殷明;李士勇;吳梨華;劉哲;付明福;;SDF-1/CXCR4軸在骨再生修復(fù)中的研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2010年10期

2 李彥林,楊志明,解慧琪,秦廷武,黃富國(guó);生物衍生骨支架材料的體外細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)修復(fù)重建外科雜志;2001年04期

3 杜子婧;楊湄;昝濤;李青峰;;熒光素酶報(bào)告基因在干細(xì)胞體內(nèi)示蹤研究中的應(yīng)用[J];組織工程與重建外科雜志;2010年01期

，

本文編號(hào)：1846330