本文選題：小干擾RNA + 中間絲波形蛋白��； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：【目的】設(shè)計(jì)篩選si RNA干擾中間絲波形蛋白(Vimentin)序列,觀察si RNA-Vimentin對(duì)脊髓損傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)和硫酸軟骨素蛋白多糖(Chondroitin Sulfate Proteoglycans,CSPG)表達(dá)的影響,分析其對(duì)脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能和神經(jīng)電生理功能恢復(fù)的作用,及其對(duì)脊髓組織GFAP、CSPG和Vimentin的表達(dá)及膠質(zhì)瘢痕形成的影響。探討si RNA作用于Vimentin在脊髓損傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和膠質(zhì)瘢痕形成過(guò)程中所起的作用�！痉椒ā吭O(shè)計(jì)3條Vimentin干擾序列,并利用Western Blot及RT-PCR篩選出沉默效果相對(duì)較好的序列;初生SD乳鼠分離培養(yǎng)皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞,并經(jīng)差速貼壁等方法純化,GFAP免疫化學(xué)熒光鑒定獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞。將細(xì)胞分為正常培養(yǎng)AS組、空載質(zhì)粒處理陰性對(duì)照組和si RNA-Vimentin轉(zhuǎn)染組,進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、MTT法測(cè)定各組細(xì)胞增殖能力,免疫熒光化學(xué)染色及RT-PCR驗(yàn)證si RNA作用于Vimentin對(duì)脊髓損傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生及膠質(zhì)瘢痕形成的影響及GFAP、CSPG和Vimentin之間的相互作用。同時(shí),采用改良Allen垂直打擊法制備SD大鼠脊髓胸10(T10)脊髓損傷動(dòng)物模型,并將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為三組:假手術(shù)組(30只)、陰性對(duì)照組(30只)和si RNA-Vimentin組(30只),于造模同時(shí)假手術(shù)組注射DMEM/F 12培養(yǎng)基5μl,陰性對(duì)照組注射DMEM/F 12培養(yǎng)基+空載質(zhì)粒5μl,si RNA-Vimentin組注射DMEM/F 12培養(yǎng)基+si RNA-Vimentin質(zhì)粒5μl。分別于術(shù)后24h、1w、2w、4w、8w和12w進(jìn)行BBB評(píng)分,并于術(shù)后24h和12w進(jìn)行SEP、MEP測(cè)定;術(shù)后4w取各組脊髓組織進(jìn)行RT-PCR測(cè)定GFAP、CSPGs和Vimentin表達(dá)情況;術(shù)后12w取各組脊髓組織計(jì)算各組膠質(zhì)瘢痕體積。收集以上各數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析�！窘Y(jié)果】設(shè)計(jì)篩選的3條si RNA干擾序列中,si RNA-Vimentin-1073相對(duì)沉默效果最好,轉(zhuǎn)染效率最高為轉(zhuǎn)染后24h,細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率80%;原代分離培養(yǎng)的SD大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞純化后,經(jīng)GFAP胞漿免疫熒光染色及DAPI細(xì)胞核染色,隨機(jī)選取6個(gè)視野觀察,GFAP陽(yáng)性細(xì)胞百分比約為(96.14±1.03)%;星形膠質(zhì)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),si RNA-Vimintin組2d/0d寬度比為(0.74±0.17),數(shù)值明顯為高(P0.05),與MTT結(jié)果共同提示si RNA作用于Vimintin對(duì)反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生有抑制作用;各組細(xì)胞免疫熒光染色積分光密度(IOD)和Western Blot檢測(cè)si RNA-Vimintin轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞后GFAP、CSPG及Vimentin的表達(dá)同時(shí)下調(diào),與正常培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞組和空載質(zhì)粒陰性對(duì)照比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);術(shù)后8w、12w si RNA-Vimentin組BBB評(píng)分提高較為明顯(P0.05);術(shù)后12w,si RNA-Vimentin組SEP、MEP與其他各組比較改善較為明顯(P0.05);術(shù)后12w,損傷早期局部注射si RNA-Vimentin的脊髓損傷大鼠模型組,膠質(zhì)瘢痕體積較對(duì)照組明顯較小(P0.05)。術(shù)后4w各組RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,si RNA-Vimentin組脊髓組織中GFAP、CSPG和Vimentin表達(dá)均顯著下調(diào)�！窘Y(jié)論】si RNA作用于Vimentin能夠下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)GFAP、CSPG,從而抑制反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生;脊髓損傷早期局部注射si RNA-Vimentin可以使脊髓損傷部位GFAP、CSPG和Vimentin表達(dá)下調(diào),三者協(xié)同發(fā)揮作用,抑制脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕的形成,為脊髓損傷后軸突再生及神經(jīng)功能恢復(fù)提供良好的微環(huán)境。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of siRNA - Vimentin on the expression of GFAP , GFAP and chondroitin sulfate in spinal cord injured rats after spinal cord injury . Methods : Three vimentin disturbance sequences were designed by Western Blot and RT - PCR . The effects of proliferation and glial scar formation in spinal cord of SD rats were determined by Western Blot and RT - PCR . The results showed that the cells were divided into three groups : sham operation group ( 30 ) , negative control group ( 30 rats ) and si RNA - Vimentin group . Compared with control group , the expression of GFAP , CUE and Vimentin in spinal cord tissue was significantly higher than that in control group ( P0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R651.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1830950