發(fā)布時間：2018-05-01 20:35

  本文選題：小干擾RNA + 中間絲波形蛋白��； 參考：《天津醫(yī)科大學》2015年博士論文

【摘要】：【目的】設計篩選si RNA干擾中間絲波形蛋白(Vimentin)序列,觀察si RNA-Vimentin對脊髓損傷后反應性星形膠質細胞膠質纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)和硫酸軟骨素蛋白多糖(Chondroitin Sulfate Proteoglycans,CSPG)表達的影響,分析其對脊髓損傷大鼠后肢運動功能和神經電生理功能恢復的作用,及其對脊髓組織GFAP、CSPG和Vimentin的表達及膠質瘢痕形成的影響。探討si RNA作用于Vimentin在脊髓損傷后反應性星形膠質細胞增生和膠質瘢痕形成過程中所起的作用�！痉椒ā吭O計3條Vimentin干擾序列,并利用Western Blot及RT-PCR篩選出沉默效果相對較好的序列;初生SD乳鼠分離培養(yǎng)皮質星形膠質細胞,并經差速貼壁等方法純化,GFAP免疫化學熒光鑒定獲得星形膠質細胞。將細胞分為正常培養(yǎng)AS組、空載質粒處理陰性對照組和si RNA-Vimentin轉染組,進行細胞劃痕實驗、MTT法測定各組細胞增殖能力,免疫熒光化學染色及RT-PCR驗證si RNA作用于Vimentin對脊髓損傷后反應性星形膠質細胞增生及膠質瘢痕形成的影響及GFAP、CSPG和Vimentin之間的相互作用。同時,采用改良Allen垂直打擊法制備SD大鼠脊髓胸10(T10)脊髓損傷動物模型,并將實驗動物隨機分為三組:假手術組(30只)、陰性對照組(30只)和si RNA-Vimentin組(30只),于造模同時假手術組注射DMEM/F 12培養(yǎng)基5μl,陰性對照組注射DMEM/F 12培養(yǎng)基+空載質粒5μl,si RNA-Vimentin組注射DMEM/F 12培養(yǎng)基+si RNA-Vimentin質粒5μl。分別于術后24h、1w、2w、4w、8w和12w進行BBB評分,并于術后24h和12w進行SEP、MEP測定;術后4w取各組脊髓組織進行RT-PCR測定GFAP、CSPGs和Vimentin表達情況;術后12w取各組脊髓組織計算各組膠質瘢痕體積。收集以上各數據進行統(tǒng)計學分析�！窘Y果】設計篩選的3條si RNA干擾序列中,si RNA-Vimentin-1073相對沉默效果最好,轉染效率最高為轉染后24h,細胞轉染效率80%;原代分離培養(yǎng)的SD大鼠皮質星形膠質細胞純化后,經GFAP胞漿免疫熒光染色及DAPI細胞核染色,隨機選取6個視野觀察,GFAP陽性細胞百分比約為(96.14±1.03)%;星形膠質細胞劃痕實驗,si RNA-Vimintin組2d/0d寬度比為(0.74±0.17),數值明顯為高(P0.05),與MTT結果共同提示si RNA作用于Vimintin對反應性膠質細胞增生有抑制作用;各組細胞免疫熒光染色積分光密度(IOD)和Western Blot檢測si RNA-Vimintin轉染星形膠質細胞后GFAP、CSPG及Vimentin的表達同時下調,與正常培養(yǎng)星形膠質細胞組和空載質粒陰性對照比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);術后8w、12w si RNA-Vimentin組BBB評分提高較為明顯(P0.05);術后12w,si RNA-Vimentin組SEP、MEP與其他各組比較改善較為明顯(P0.05);術后12w,損傷早期局部注射si RNA-Vimentin的脊髓損傷大鼠模型組,膠質瘢痕體積較對照組明顯較小(P0.05)。術后4w各組RT-PCR檢測結果顯示,si RNA-Vimentin組脊髓組織中GFAP、CSPG和Vimentin表達均顯著下調�！窘Y論】si RNA作用于Vimentin能夠下調星形膠質細胞表達GFAP、CSPG,從而抑制反應性星形膠質細胞增生;脊髓損傷早期局部注射si RNA-Vimentin可以使脊髓損傷部位GFAP、CSPG和Vimentin表達下調,三者協(xié)同發(fā)揮作用,抑制脊髓損傷后膠質瘢痕的形成,為脊髓損傷后軸突再生及神經功能恢復提供良好的微環(huán)境。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of siRNA - Vimentin on the expression of GFAP , GFAP and chondroitin sulfate in spinal cord injured rats after spinal cord injury . Methods : Three vimentin disturbance sequences were designed by Western Blot and RT - PCR . The effects of proliferation and glial scar formation in spinal cord of SD rats were determined by Western Blot and RT - PCR . The results showed that the cells were divided into three groups : sham operation group ( 30 ) , negative control group ( 30 rats ) and si RNA - Vimentin group . Compared with control group , the expression of GFAP , CUE and Vimentin in spinal cord tissue was significantly higher than that in control group ( P0.05 ) .

【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R651.2

【共引文獻】

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本文編號：1830950