發(fā)布時間：2018-04-27 04:14

  本文選題：椎間盤退行性改變 + 環(huán)狀RNA��； 參考：《天津醫(yī)科大學》2017年碩士論文

【摘要】：[目的]腰背痛已經成為全世界范圍內最常見的肌肉骨骼疾病之一,具有發(fā)病率高、治療難度大、遠期治療效果欠佳的特點。研究顯示許多因素都可以導致腰背部疼痛,椎間盤退行性改變(intervertebral disk degeneration,IDD)被認為是其中最重要的因素之一。IDD是一個由細胞介導的異常反應,包括:1.髓核(nucleus pulposus,NP)部分基質成分合成減少;2.基質金屬蛋白酶含量的增加;3.NP細胞的凋亡及死亡。研究表明非編碼RNA (non-coding RNA,ncRNA)廣泛存在于生命體當中,而且可以通過調節(jié)基因的表達在許多生物學過程中發(fā)揮重要的作用。環(huán)狀RNA (cicular RNA,circRNA)是近來新發(fā)現的一類ncRNA,可通過吸附微小RNA (microRNA,miRNA)在細胞質中作為miRNA海綿,發(fā)揮競爭性內源RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)的作用,起到促進miRNA靶基因表達的作用�，F已證實RNA調控網絡的異常在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中都起到重要作用。然而,目前circRNA在IDD過程中的調控作用及相關機制尚缺乏報道。本實驗旨在利用生物信息學方法尋找IDD過程中起關鍵調控作用的circRNA,并探索其在IDD過程中的調控機制。[方法]1.通過HE染色方法觀察退變的NP組織的形態(tài)學改變。2.通過TUNEL熒光染色觀察退變的NP組織中NP細胞的凋亡情況。3.從GEO數據庫下載的正常NP組織和退變的NP組織中circRNA和microRNA芯片數據并進行差異表達分析,尋找關鍵circRNA以及與其表達呈負性相關的microRNA。4.通過熒光原位雜交的方法檢測關鍵circRNA和與其存在顯著負相關的microRNA在NP細胞內定位。5.采用熒光素酶報告基因實驗檢測關鍵circRNA和microRNA的結合位點。6.隨后利用 miRPathDBv1.O、DIANA-miRPathv3.0、TargetScan數據庫預測關鍵microRNA調控的通路,同時利用DIANA,miRTarBase,TargetScan,miRDB數據庫預測該microRNA靶基因。7.在NP細胞內分別過表達關鍵circRNA和關鍵microRNA,利用Western blotting和RT-PCR檢測靶基因的表達情況。8.通過流式細胞儀檢測關鍵circRNA對NP細胞凋亡的影響。[結果]本研究通過檢索GEO數據庫中關于IDD的circRNA芯片數據,構建circRNA在退變的椎間盤NP細胞中的表達譜,隨后通過生物信息學方法篩選出104條差異表達的circRNA,并且預測出343個microRNA應答元件。近一步結合樣本來源相同的miRNA芯片數據及相關性分析,預測出circ-GRB1O和miR-328-5p的相互調控關系。通過原位雜交實驗驗證了 circ-GRB10和miR-328-5p在NP細胞質中存在共定位關系,并且觀察到circ-GRB10和miR-328-5p在NP細胞中表達量的變化,近一步證實了芯片分析的結果。在circ-GRB1O的生物功能學驗證的實驗部分,本研究通過熒光素酶報告基因實驗證實了 circ-GRB10作為miR-328-5p海綿的作用,并且確定了 circ-GRB10和 miR-328-5p 的相互作用位點。通過 miRPathDBv1.O、DIANA-miRPathv3.0、TargetScan數據庫預測miR-328-5p的調控通路,同時利用DIANA,miRTarBase,TargetScan,miRDB數據庫預測miR-328-5p靶基因,并與上述通路信息相結合,本研究最后確定ERBB2為miR-328-5p的靶基因。隨后在細胞水平上,本研究證實:1. NP細胞中過表達miR-328-5p可以下調ERBB2的表達,而circ-GRB1O可以抑制miR-328-5p作用,上調NP細胞中ERBB2的含量;2.在NP細胞中抑制circ-GRB1O的表達,可以下調ERBB2的含量,并且促進NP細胞的凋亡。[結論]1.本研究表明大量circRNA參與了 IDD的發(fā)生、發(fā)展過程,并且circ-GRB 10作為IDD過程中的關鍵circRNA具有抑制NP細胞凋亡的重要作用。2.揭示了 circ-GRB10-miR-328-5p-ERBB2調控網絡的平衡在NP細胞凋亡過程中的重要作用。3.為IDD的發(fā)生、發(fā)展過程中相關機制的研究提供了新的思路。
[Abstract]:[Objective] low back pain has become one of the most common musculoskeletal diseases worldwide, characterized by high incidence, difficulty in treatment, and poor long-term treatment. Research shows that many factors can lead to pain in the back and intervertebral disk degeneration (IDD) is considered to be the most important. One of the factors,.IDD, is a cell mediated abnormal reaction, including a decrease in the composition of part of the 1. nucleus (nucleus pulposus, NP), the increase in the content of the 2. matrix metalloproteinase, the apoptosis and death of the 3.NP cells. The study shows that the non coded RNA (non-coding RNA, ncRNA) exists widely in the life body and can be used by the regulatory group. The expression of the cause plays an important role in many biological processes. Cicular RNA (circRNA) is a newly discovered class of ncRNA, which can play the role of competitive endogenous RNA (competitive endogenous) by adsorbing small RNA (microRNA, miRNA) as a miRNA sponge in the cytoplasm, to promote the expression of the target gene expression. It has been proved that the abnormality of the RNA regulatory network plays an important role in the development and development of various diseases. However, the regulatory role and related mechanisms of circRNA in the IDD process are not yet reported. This experiment aims to explore the key regulatory role of circRNA in the process of IDD using bioinformatics methods and explore its IDD in the process. Regulatory mechanism in the process. [method]1. observe the morphological changes of the degenerative NP tissue by HE staining method.2. through TUNEL fluorescence staining to observe the apoptosis of NP cells in the NP tissue of the degenerated.3.,.3. from the normal NP tissue and the NP tissue from the GEO database and the differential expression analysis of the circRNA and chip data in the NP tissue of the degenerative NP. Key circRNA and microRNA.4., which are negatively related to its expression, detect key circRNA and its significant negative correlation microRNA in NP cells by fluorescence in situ hybridization..5. uses luciferase reporter gene test to detect the binding site of key circRNA and microRNA, and then uses miRPathDBv1.O, DIANA-miRPat Hv3.0, TargetScan database predicts critical microRNA regulation pathway, and uses DIANA, miRTarBase, TargetScan, miRDB database to predict the key circRNA and key microRNA in NP cells. The effect of key circRNA on the apoptosis of NP cells. [results] by searching the circRNA chip data of IDD in the GEO database, the expression of circRNA in the degeneration of intervertebral disc NP cells was constructed, and then 104 differentially expressed circRNA were screened by bioinformatics method, and 343 microRNA response elements were predicted. The same miRNA chip data and correlation analysis were used to predict the mutual regulation relationship between circ-GRB1O and miR-328-5p. The co localization relationship between circ-GRB10 and miR-328-5p in the cytoplasm of NP was verified by in situ hybridization, and the changes in the expression of circ-GRB10 and miR-328-5p in NP cells were observed, and the core was confirmed in the last step. The results of the slice analysis. In the experimental part of circ-GRB1O's biofunctional verification, this study confirmed the role of circ-GRB10 as a miR-328-5p sponge by luciferase reporter gene experiment, and determined the interaction sites between circ-GRB10 and miR-328-5p. The prediction of miR by miRPathDBv1.O, DIANA-miRPathv3.0, TargetScan database. -328-5p regulation pathway, simultaneously using DIANA, miRTarBase, TargetScan, miRDB database to predict miR-328-5p target gene, and combined with the pathway information, this study finally determined the ERBB2 as the target gene for miR-328-5p. Then at the cell level, this study confirmed that 1. NP fine cell overexpressed miR-328-5p can downregulate ERBB2 expression, and circ-G RB1O can inhibit the effect of miR-328-5p and increase the content of ERBB2 in NP cells; 2. inhibiting the expression of circ-GRB1O in NP cells can reduce the content of ERBB2 and promote the apoptosis of NP cells. [conclusion]1. this study showed that a large number of circRNA participated in IDD occurrence, development process, and circ-GRB 10 was a key inhibitor in the process. The important role of NP cell apoptosis.2. reveals that the balance of circ-GRB10-miR-328-5p-ERBB2 regulatory network plays an important role in the process of NP cell apoptosis,.3. is the occurrence of IDD, and the research of related mechanisms in the process of development provides a new way of thinking.

【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R681.55

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本文編號：1809127