本文選題：椎間盤(pán)退行性改變 + 環(huán)狀RNA�。� 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：[目的]腰背痛已經(jīng)成為全世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的肌肉骨骼疾病之一,具有發(fā)病率高、治療難度大、遠(yuǎn)期治療效果欠佳的特點(diǎn)。研究顯示許多因素都可以導(dǎo)致腰背部疼痛,椎間盤(pán)退行性改變(intervertebral disk degeneration,IDD)被認(rèn)為是其中最重要的因素之一。IDD是一個(gè)由細(xì)胞介導(dǎo)的異常反應(yīng),包括:1.髓核(nucleus pulposus,NP)部分基質(zhì)成分合成減少;2.基質(zhì)金屬蛋白酶含量的增加;3.NP細(xì)胞的凋亡及死亡。研究表明非編碼RNA (non-coding RNA,ncRNA)廣泛存在于生命體當(dāng)中,而且可以通過(guò)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)在許多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。環(huán)狀RNA (cicular RNA,circRNA)是近來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)ncRNA,可通過(guò)吸附微小RNA (microRNA,miRNA)在細(xì)胞質(zhì)中作為miRNA海綿,發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)的作用,起到促進(jìn)miRNA靶基因表達(dá)的作用。現(xiàn)已證實(shí)RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的異常在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中都起到重要作用。然而,目前circRNA在IDD過(guò)程中的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制尚缺乏報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在利用生物信息學(xué)方法尋找IDD過(guò)程中起關(guān)鍵調(diào)控作用的circRNA,并探索其在IDD過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制。[方法]1.通過(guò)HE染色方法觀察退變的NP組織的形態(tài)學(xué)改變。2.通過(guò)TUNEL熒光染色觀察退變的NP組織中NP細(xì)胞的凋亡情況。3.從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載的正常NP組織和退變的NP組織中circRNA和microRNA芯片數(shù)據(jù)并進(jìn)行差異表達(dá)分析,尋找關(guān)鍵circRNA以及與其表達(dá)呈負(fù)性相關(guān)的microRNA。4.通過(guò)熒光原位雜交的方法檢測(cè)關(guān)鍵circRNA和與其存在顯著負(fù)相關(guān)的microRNA在NP細(xì)胞內(nèi)定位。5.采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)關(guān)鍵circRNA和microRNA的結(jié)合位點(diǎn)。6.隨后利用 miRPathDBv1.O、DIANA-miRPathv3.0、TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)關(guān)鍵microRNA調(diào)控的通路,同時(shí)利用DIANA,miRTarBase,TargetScan,miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)該microRNA靶基因。7.在NP細(xì)胞內(nèi)分別過(guò)表達(dá)關(guān)鍵circRNA和關(guān)鍵microRNA,利用Western blotting和RT-PCR檢測(cè)靶基因的表達(dá)情況。8.通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)關(guān)鍵circRNA對(duì)NP細(xì)胞凋亡的影響。[結(jié)果]本研究通過(guò)檢索GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于IDD的circRNA芯片數(shù)據(jù),構(gòu)建circRNA在退變的椎間盤(pán)NP細(xì)胞中的表達(dá)譜,隨后通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選出104條差異表達(dá)的circRNA,并且預(yù)測(cè)出343個(gè)microRNA應(yīng)答元件。近一步結(jié)合樣本來(lái)源相同的miRNA芯片數(shù)據(jù)及相關(guān)性分析,預(yù)測(cè)出circ-GRB1O和miR-328-5p的相互調(diào)控關(guān)系。通過(guò)原位雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 circ-GRB10和miR-328-5p在NP細(xì)胞質(zhì)中存在共定位關(guān)系,并且觀察到circ-GRB10和miR-328-5p在NP細(xì)胞中表達(dá)量的變化,近一步證實(shí)了芯片分析的結(jié)果。在circ-GRB1O的生物功能學(xué)驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)部分,本研究通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了 circ-GRB10作為miR-328-5p海綿的作用,并且確定了 circ-GRB10和 miR-328-5p 的相互作用位點(diǎn)。通過(guò) miRPathDBv1.O、DIANA-miRPathv3.0、TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-328-5p的調(diào)控通路,同時(shí)利用DIANA,miRTarBase,TargetScan,miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-328-5p靶基因,并與上述通路信息相結(jié)合,本研究最后確定ERBB2為miR-328-5p的靶基因。隨后在細(xì)胞水平上,本研究證實(shí):1. NP細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-328-5p可以下調(diào)ERBB2的表達(dá),而circ-GRB1O可以抑制miR-328-5p作用,上調(diào)NP細(xì)胞中ERBB2的含量;2.在NP細(xì)胞中抑制circ-GRB1O的表達(dá),可以下調(diào)ERBB2的含量,并且促進(jìn)NP細(xì)胞的凋亡。[結(jié)論]1.本研究表明大量circRNA參與了 IDD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程,并且circ-GRB 10作為IDD過(guò)程中的關(guān)鍵circRNA具有抑制NP細(xì)胞凋亡的重要作用。2.揭示了 circ-GRB10-miR-328-5p-ERBB2調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的平衡在NP細(xì)胞凋亡過(guò)程中的重要作用。3.為IDD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中相關(guān)機(jī)制的研究提供了新的思路。
[Abstract]:[Objective] low back pain has become one of the most common musculoskeletal diseases worldwide, characterized by high incidence, difficulty in treatment, and poor long-term treatment. Research shows that many factors can lead to pain in the back and intervertebral disk degeneration (IDD) is considered to be the most important. One of the factors,.IDD, is a cell mediated abnormal reaction, including a decrease in the composition of part of the 1. nucleus (nucleus pulposus, NP), the increase in the content of the 2. matrix metalloproteinase, the apoptosis and death of the 3.NP cells. The study shows that the non coded RNA (non-coding RNA, ncRNA) exists widely in the life body and can be used by the regulatory group. The expression of the cause plays an important role in many biological processes. Cicular RNA (circRNA) is a newly discovered class of ncRNA, which can play the role of competitive endogenous RNA (competitive endogenous) by adsorbing small RNA (microRNA, miRNA) as a miRNA sponge in the cytoplasm, to promote the expression of the target gene expression. It has been proved that the abnormality of the RNA regulatory network plays an important role in the development and development of various diseases. However, the regulatory role and related mechanisms of circRNA in the IDD process are not yet reported. This experiment aims to explore the key regulatory role of circRNA in the process of IDD using bioinformatics methods and explore its IDD in the process. Regulatory mechanism in the process. [method]1. observe the morphological changes of the degenerative NP tissue by HE staining method.2. through TUNEL fluorescence staining to observe the apoptosis of NP cells in the NP tissue of the degenerated.3.,.3. from the normal NP tissue and the NP tissue from the GEO database and the differential expression analysis of the circRNA and chip data in the NP tissue of the degenerative NP. Key circRNA and microRNA.4., which are negatively related to its expression, detect key circRNA and its significant negative correlation microRNA in NP cells by fluorescence in situ hybridization..5. uses luciferase reporter gene test to detect the binding site of key circRNA and microRNA, and then uses miRPathDBv1.O, DIANA-miRPat Hv3.0, TargetScan database predicts critical microRNA regulation pathway, and uses DIANA, miRTarBase, TargetScan, miRDB database to predict the key circRNA and key microRNA in NP cells. The effect of key circRNA on the apoptosis of NP cells. [results] by searching the circRNA chip data of IDD in the GEO database, the expression of circRNA in the degeneration of intervertebral disc NP cells was constructed, and then 104 differentially expressed circRNA were screened by bioinformatics method, and 343 microRNA response elements were predicted. The same miRNA chip data and correlation analysis were used to predict the mutual regulation relationship between circ-GRB1O and miR-328-5p. The co localization relationship between circ-GRB10 and miR-328-5p in the cytoplasm of NP was verified by in situ hybridization, and the changes in the expression of circ-GRB10 and miR-328-5p in NP cells were observed, and the core was confirmed in the last step. The results of the slice analysis. In the experimental part of circ-GRB1O's biofunctional verification, this study confirmed the role of circ-GRB10 as a miR-328-5p sponge by luciferase reporter gene experiment, and determined the interaction sites between circ-GRB10 and miR-328-5p. The prediction of miR by miRPathDBv1.O, DIANA-miRPathv3.0, TargetScan database. -328-5p regulation pathway, simultaneously using DIANA, miRTarBase, TargetScan, miRDB database to predict miR-328-5p target gene, and combined with the pathway information, this study finally determined the ERBB2 as the target gene for miR-328-5p. Then at the cell level, this study confirmed that 1. NP fine cell overexpressed miR-328-5p can downregulate ERBB2 expression, and circ-G RB1O can inhibit the effect of miR-328-5p and increase the content of ERBB2 in NP cells; 2. inhibiting the expression of circ-GRB1O in NP cells can reduce the content of ERBB2 and promote the apoptosis of NP cells. [conclusion]1. this study showed that a large number of circRNA participated in IDD occurrence, development process, and circ-GRB 10 was a key inhibitor in the process. The important role of NP cell apoptosis.2. reveals that the balance of circ-GRB10-miR-328-5p-ERBB2 regulatory network plays an important role in the process of NP cell apoptosis,.3. is the occurrence of IDD, and the research of related mechanisms in the process of development provides a new way of thinking.

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R681.55

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本文編號(hào)：1809127