本文選題：microRNA-27a + BMSC�。� 參考：《鄭州大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：研究背景:股骨頭壞死是一種臨床上非常常見的關(guān)節(jié)疾病,該病病因復(fù)雜,致殘率高,一旦發(fā)病往往需要手術(shù)治療,迄今罕有有效的預(yù)防方法,對(duì)患者的生活質(zhì)量和生命健康都是一種嚴(yán)重威脅。目前非創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死(Osteonecrosis of the femoral head,ONFH)日益多見,大量研究證明,慢性股骨頭壞死多與激素和酒精的攝入有關(guān)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,在中國(guó),慢性酒精中毒已經(jīng)是誘發(fā)ONFH的主要原因之一。有研究表明,通過對(duì)大鼠、小鼠、家兔和雞等長(zhǎng)期使用大劑量酒精灌胃處理后,動(dòng)物會(huì)在一定時(shí)間后出現(xiàn)明顯的股骨頭壞死現(xiàn)象。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是一種多能干細(xì)胞,主要分化為成骨細(xì)胞,并能夠分化為脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等。體外培養(yǎng)的BMSCs經(jīng)過酒精誘導(dǎo)后,會(huì)大量分化成脂肪樣細(xì)胞,喪失成骨能力。過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ,PPARγ)基因是一種關(guān)鍵的成脂轉(zhuǎn)錄因子,其在脂肪細(xì)胞中表達(dá)量非常高,且PPARγ的激活與干細(xì)胞的分化命運(yùn)密切相關(guān)。大量研究表明,BMSC中PPARγ的激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞成骨分化受阻,細(xì)胞轉(zhuǎn)而向成脂方向分化,該過程在股骨頭壞死過程中表現(xiàn)為骨質(zhì)喪失和骨骼或關(guān)節(jié)修復(fù)受阻。Micro RNA是一種長(zhǎng)度約20~24個(gè)核苷酸的短鏈非編碼RNA,不同類型的micro RNA根據(jù)其特異的核苷酸序列可以靶向作用于不同基因的m RNA,在m RNA轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)狀況。micro RNAs的正常表達(dá)對(duì)維持正常生命活動(dòng)至關(guān)重要,至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約60%的人類基因受micro RNAs的調(diào)控。一個(gè)micro RNA可以靶向調(diào)節(jié)多個(gè)基因,并且一個(gè)基因也可以被多個(gè)micro RNAs所調(diào)控。我們通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)micro RNA-27a能夠與PPARγ基因靶向配對(duì),抑制BMSC中PPARγ的表達(dá),阻礙BMSC的成脂分化,進(jìn)而使BMSC正常的成骨分化能力得以恢復(fù),從而達(dá)到對(duì)酒精性O(shè)NFH發(fā)生的抑制作用。研究目的:本實(shí)驗(yàn)通過體外合成micro RNA-27a mimics導(dǎo)入大鼠BMSCs細(xì)胞,觀察micro RNA-27a對(duì)PPARγ基因的靶向調(diào)控作用,及對(duì)酒精誘導(dǎo)的BMSC成脂和成骨分化的影響,以此探討micro RNA在ONFH的發(fā)生及防治中的作用。方法:1.實(shí)驗(yàn)分組:將大鼠BMSCs以1×106/cm2細(xì)胞密度,接種于6孔培養(yǎng)板,當(dāng)細(xì)胞融合至80%時(shí)應(yīng)用micro RNA mimics進(jìn)行電擊穿孔法轉(zhuǎn)染,同時(shí)隨機(jī)分組:①空白對(duì)照組:正常培養(yǎng)細(xì)胞,不做特殊處理。②酒精模型組:培養(yǎng)液中給予0.09 mol/L的酒精。③micro RNA-27a組:micro RNA-27a mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞,并給予濃度為0.09mol/L的酒精同時(shí)處理。④Negative control組:無關(guān)序列合成mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞,并給予濃度為0.09mol/L的酒精同時(shí)處理。2.熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)micro RNA-27a與PPARγ3’UTR的結(jié)合情況。3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,Q-PCR)檢測(cè)各組BMSCs中PAPRγ和Runx2基因表達(dá)的水平。4.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)各組中堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、I型膠原(type I collagen)和骨鈣素(osteocalcin,OCN)含量的差異。5.免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)各組BMSCs中Runx2和PPARγ的蛋白表達(dá)水平。6.脂肪染色及脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)BMSCs酒精誘導(dǎo)后脂肪生成的狀態(tài)和成脂分化的程度。7.酶偶聯(lián)比色法檢測(cè)BMSCs中甘油三酯(TG)的含量。結(jié)果:1)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)micro RNA-27a可以與PPARγ3’-UTR相結(jié)合,即PPARγ是micro RNA-27a的靶基因。2)q PCR結(jié)果顯示:酒精處理后,酒精模型組和NC組BMSC中PPARγm RNA表達(dá)量均高于空白對(duì)照組和micro RNA-27a組(P0.01),空白對(duì)照組和micro RNA-27a組比較,以及酒精模型組和NC組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㧐0.05);與此相反,酒精模型組和NC組BMSC中Runx2 m RNA表達(dá)量均低于空白對(duì)照組和micro RNA-27a組(P0.01),空白對(duì)照組與micro RNA-27a組比較,以及酒精模型組和NC組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㧐0.05)。3)ALP檢測(cè)結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組比較,酒精模型組和NC組BMSC經(jīng)酒精處理后ALP含量均有下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),而micro RNA-27a組中ALP含量與空白對(duì)照組近似,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㧐0.05)。4)I型膠原檢測(cè)結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組比較,酒精模型組和NC組BMSC經(jīng)酒精處理后I型膠原含量均有下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),而micro RNA-27a組中I型膠原含量與空白對(duì)照組近似,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㧐0.05)。5)OCN檢測(cè)結(jié)果顯示:酒精模型組和NC組培養(yǎng)液中OCN的含量與空白對(duì)照組及micro RNA-27a組比較均有下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)�？瞻讓�(duì)照組與micro RNA-27a組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㧐0.05)。6)Western blot結(jié)果顯示:酒精模型組和NC組與空白對(duì)照組比較BMSC中PPARγ的蛋白表達(dá)量明顯上升(P0.01),micro RNA-27a組PPARγ蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組接近,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㧐0.05)。同時(shí),酒精模型組和NC組與空白對(duì)照組比較BMSC中Runx2的蛋白表達(dá)量明顯下降(P0.01),micro RNA-27a組Runx2蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㧐0.05)。7)脂肪染色及脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果:油紅O染色顯示,空白對(duì)照組和micro RNA27a組細(xì)胞中罕見脂滴生成且極少出現(xiàn)脂肪細(xì)胞;酒精模型組及NC組細(xì)胞,胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)較多脂肪滴且有大量脂肪細(xì)胞生成,著色后呈棕紅色。脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,酒精模型組和NC組脂肪細(xì)胞生成數(shù)比micro RNA-27a組和空白對(duì)照明顯增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);空白對(duì)照組與micro RNA-27a組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㧐0.05)。8)TG含量測(cè)定結(jié)果顯示,酒精模型組和NC組表達(dá)含量均高于空白對(duì)照組與micro RNA-27a組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。空白對(duì)照組與micro RNA-27a組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㧐0.05)。結(jié)論:1.micro RNA27a能夠靶向調(diào)節(jié)PPARγ基因,下調(diào)BMSC中PPARγ基因的表達(dá),減少脂肪細(xì)胞生成,降低細(xì)胞中TG的含量,抑制酒精誘導(dǎo)的BMSCs成脂分化能力。2.BMSCs細(xì)胞中Runx2基因表達(dá)的升高,ALP活性、I型膠原和OCN含量的增加,促進(jìn)BMSCs成骨分化。3.micro RNA27a在預(yù)防酒精性O(shè)NFH發(fā)生中發(fā)揮一定作用。
[Abstract]:Bone marrow stromal cells ( BMSC ) are a key factor in the development of bone marrow stromal cells ( bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells and neural cells ) . Objective : To investigate the effect of micro RNA - 27a on PPAR緯 gene expression and to investigate the effect of micro RNA - 27a on PPAR緯 gene expression . Compared with blank control group , the expression of PPAR緯 mRNA in the alcohol model group and NC group was significantly higher than that in blank control group ( P0.01 ) . Conclusion : 1 . MicroRNA27a can regulate PPAR緯 gene , decrease the expression of PPAR緯 gene in BMSC , decrease the expression of PPAR緯 gene in BMSC , decrease the expression of PPAR緯 gene in BMSC , decrease the expression of PPAR緯 gene in BMSC , decrease the content of TG in BMSC , inhibit the increase of activity of ALP , type I collagen and OCN , and promote the differentiation of bone into bone . 3 . MicroRNA27a plays a role in preventing alcoholic ONFH .

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R681.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1740041