本文選題：PEDOT　切入點：去細(xì)胞組織　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：第一部分去細(xì)胞組織表面化學(xué)原位聚合法構(gòu)建PEDOT人工套管支架中文摘要研究背景:周圍神經(jīng)損傷會導(dǎo)致長期、嚴(yán)重的功能障礙,其修復(fù)是公認(rèn)的臨床治療難題之一。經(jīng)典的神經(jīng)縫合術(shù)和神經(jīng)移植術(shù)均存在十分明顯的治療缺陷,尋求可靠的移植替代品是近年來周圍神經(jīng)損傷領(lǐng)域主要的研究方向。自體組織去細(xì)胞化支架由于可以保留細(xì)胞外機制的主要骨架成分,去除起主要致敏原性的細(xì)胞成分,是一種很有潛力的支架材料。聚3,4-乙烯二氧噻吩(poly 3,4-ethylenedioxythiophene,PEDOT)具有生物相容性好、導(dǎo)電性強的特點,是一種極具生物應(yīng)用潛力的聚合材料。傳統(tǒng)制備工藝多為電化學(xué)法,但化學(xué)聚合法更適合以生物體組織為底物進行制備。目的:本實驗擬利用化學(xué)去細(xì)胞方法制備大鼠去細(xì)胞肌肉支架,隨后采用化學(xué)聚合法,使EDOT單體在不易導(dǎo)電的去細(xì)胞組織表面原位聚合,制備新型去細(xì)胞-PEDOT神經(jīng)套管支架,觀察其大體及超微結(jié)構(gòu),測量產(chǎn)物中各化學(xué)成分,評估整個制備過程的生物安全性,為下一步應(yīng)用于周圍神經(jīng)損傷的研究做好準(zhǔn)備。方法:實驗采用SD大鼠,獲取大鼠股外側(cè)肌肌肉組織,通過NaN3/SDS/TritonX-100化學(xué)去細(xì)胞方法獲得去細(xì)胞組織支架。隨后以FeC13為主體構(gòu)建化學(xué)氧化法聚合體系,在去細(xì)胞組織支架表面進行EDOT單體原位聚合反應(yīng),共分為對照組(單純?nèi)ゼ?xì)胞支架組),去細(xì)胞+PEDOT1組(僅進行單一循環(huán)聚合反應(yīng))和去細(xì)胞+PEDOT6組(進行6個循環(huán)聚合反應(yīng))。將獲取到的各組產(chǎn)物支架,分別觀察光鏡下微結(jié)構(gòu)和電鏡下超微結(jié)構(gòu)。利用X射線光電子能譜(XPS)技術(shù)檢測產(chǎn)物支架表面各元素成分比例,判斷化學(xué)反應(yīng)后產(chǎn)物試劑殘留情況。利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)測量產(chǎn)物組織深層鐵元素總含量。應(yīng)用排液法測定各組產(chǎn)物的孔隙率,應(yīng)用四探針測試儀測量產(chǎn)物的電導(dǎo)率。結(jié)果:應(yīng)用化學(xué)去細(xì)胞法成功獲得去細(xì)胞肌肉組織支架,大體觀呈乳白色,超微結(jié)構(gòu)見復(fù)雜纖維束狀結(jié)構(gòu),具備良好柔韌性。應(yīng)用氧化法使EDOT單體在去細(xì)胞組織表面成功聚合為PEDOT多聚物,形成的去細(xì)胞-PEDOT支架大體觀變?yōu)楹谏?體積較聚合反應(yīng)前有所縮小,硬度較前有所增加。超微結(jié)構(gòu)見PEDOT聚合物不僅存在于去細(xì)胞組織表面,而且穿透進入組織超微結(jié)構(gòu)中,形成黑色條索結(jié)構(gòu)。去除細(xì)胞成分后的去細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)雖然仍保留有沿纖維方向縱向延伸的大概結(jié)構(gòu),但在各個方向上均具有各向異性的特點,因此在聚合反應(yīng)后產(chǎn)物中也保留了各項異性的特性。通過各組間圖像比較可見,隨著聚合反應(yīng)循環(huán)次數(shù)增多,PEDOT多聚物包裹層逐漸增厚。XPS能譜分析可知超聲清洗后產(chǎn)物表面鐵元素含量明顯下降,大部分鐵元素可能已經(jīng)進入產(chǎn)物內(nèi)部。元素分析結(jié)果確認(rèn)鐵元素主要在產(chǎn)物組織內(nèi)部�？紫堵蕼y定結(jié)果確認(rèn)各組產(chǎn)物均具有超過85%的孔隙率,其中去細(xì)胞組織孔隙率最高,隨聚合反應(yīng)循環(huán)次數(shù)增多,孔隙率逐漸小幅下降。單純?nèi)ゼ?xì)胞組織電導(dǎo)率小于10-7數(shù)量級,PEDOT各組產(chǎn)物電導(dǎo)率均為10-4數(shù)量級,具備了傳導(dǎo)生物電信號的基本條件。結(jié)論:本部分實驗證實了應(yīng)用化學(xué)去細(xì)胞法可以成功獲得大鼠肌肉組織去細(xì)胞支架,在其表面應(yīng)用化學(xué)氧化聚合法可以成功使EDOT原位聚合,獲得去細(xì)胞-PEDOT復(fù)合支架。由于在制備過程中反復(fù)應(yīng)用了超聲清洗技術(shù),通過XPS和元素分析技術(shù)證實鐵元素等反應(yīng)雜質(zhì)在最終產(chǎn)物表面基本無明顯殘留,鐵元素主要存在于支架結(jié)構(gòu)內(nèi)部,其釋放量在動物體安全范圍之內(nèi)�？紫堵蕼y定確認(rèn)各組產(chǎn)物均具有極高的孔隙率,PEDOT各組產(chǎn)物電導(dǎo)率均為10-4數(shù)量級,可認(rèn)為PEDOT聚合后各組產(chǎn)物具備傳導(dǎo)人體內(nèi)生物電信號的功能,符合其在周圍神經(jīng)領(lǐng)域應(yīng)用的基本要求。因此這種去細(xì)胞-PEDOT復(fù)合支架具備了可以引導(dǎo)損傷后神經(jīng)軸突增生修復(fù)的良好特性,為下一步周圍神經(jīng)損傷的研究做好了充足的準(zhǔn)備工作。第二部分?jǐn)y帶BMSCs的PEDOT人工套管支架對周圍神經(jīng)損傷的治療研究及相關(guān)機制探討研究背景:周圍神經(jīng)損傷會導(dǎo)致長期、嚴(yán)重的功能障礙,其修復(fù)是公認(rèn)的臨床治療難題之一。經(jīng)典的自體神經(jīng)移植術(shù)由于神經(jīng)來源有限,具有很大的使用局限。前期工作已經(jīng)獲得了具有生物應(yīng)用性能的PEDOT神經(jīng)導(dǎo)管。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)具有向多種細(xì)胞分化的潛能,可以分化成對神經(jīng)遞質(zhì)敏感的并具有神經(jīng)電生理功能的類神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等,同時還可以分泌多種促神經(jīng)生長因子促進周圍受損的髓鞘和神經(jīng)纖維恢復(fù)。在相關(guān)機制研究中,微小RNA和Notch信號通路系統(tǒng)均為重要的研究熱點。目的:本部分實驗利用體內(nèi)及體外動物實驗確定自體BMSC填充PEDOT人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)支架后BMSC的分化增生情況,評估其對周圍神經(jīng)損傷的治療作用,探究Notch信號通路在BMSCs充填的PEDOT對外周神經(jīng)損傷的作用。利用熒光定量PCR技術(shù)、western-blot技術(shù)結(jié)合細(xì)胞轉(zhuǎn)染,檢測BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化過程中相關(guān)因子(如:miR-21)的表達及Notch信號活性變化。最終探討Notch信號通路在BMSC填充PEDOT人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)支架后,大鼠神經(jīng)損傷的程度以及修復(fù)程度,為該技術(shù)的下一步臨床及基礎(chǔ)研究提供參考。方法:實驗采用SD大鼠,通過獲取大鼠股骨及脛骨骨組織,通過標(biāo)準(zhǔn)方法獲得骨髓細(xì)胞懸液,將其全部接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中并將培養(yǎng)瓶置于37℃、體積比為5%C02、適宜濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。45只雄性SD大鼠,在同一水平利刀切除一段坐骨神經(jīng)造成8 mm缺損,而后隨機分為3組并接受相應(yīng)處理,其中:A組:對照組,實行假手術(shù);B組:PEDOT人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)支架;C組:PEDOT人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)支架+ BMSCs。用BMSCs填充的PEDOT人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)支架連接神經(jīng)缺損處,規(guī)定時間后處死大鼠測量缺損神經(jīng)的電信號傳導(dǎo)恢復(fù)情況,同時觀察BMSC在離體導(dǎo)管內(nèi)的存活及分化情況。通過染色觀察神經(jīng)軸突及髓鞘再生情況,觀察支架內(nèi)及周圍周圍神經(jīng)生長因子的分泌情況。利用熒光定量PCR、western-blot結(jié)合BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化誘導(dǎo)等方法,檢測BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化過程中,相關(guān)分子miR-21表達情況及Notch信號通路相關(guān)蛋白Hes1和NICD的表達活性。隨后,通過miR-21過表達/抑制,同時激活或抑制Notch信號途徑等處理BMSCs,檢測六種神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記分子(NSE,巢蛋白,GFAP,NF-M,MAP-2和β 3-微管蛋白)的表達變化,以及神經(jīng)動作電位幅度、神經(jīng)傳導(dǎo)速度的變化。結(jié)果:A組(Control)坐骨神經(jīng)外形正常,B組(PEDOT)神經(jīng)斷端可見局部膨大;C組(PEDOT+BMSCs)神經(jīng)連接處無明顯瘢痕形成,未見導(dǎo)管腫脹變性、吻合口斷裂及神經(jīng)瘤形成現(xiàn)象。肌電圖檢查結(jié)果顯示,B組神經(jīng)動作電位幅度和神經(jīng)傳導(dǎo)速度顯著低于A組,而C組神經(jīng)動作電位幅度和神經(jīng)傳導(dǎo)速度顯著高于B組,接近A組水平。實時PCR結(jié)果證實,在BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化過程中,miR-21表達增加,Notch信號表達增強。過表達miR-21或激活Notch信號,均促進BMSCs向神經(jīng)分化的能力,抑制Notch信號則逆轉(zhuǎn)miR-21對BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的促進效應(yīng);干擾miR-21則會抑制神經(jīng)動作電位幅度和神經(jīng)傳導(dǎo)速度。結(jié)論:本項目證實了攜帶BMSC的PEDOT神經(jīng)導(dǎo)管治療周圍神經(jīng)損傷的可行性,在動物體內(nèi)試驗中可以對大鼠坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)組織的修復(fù)產(chǎn)生明顯促進作用;項目探究了 Notch信號通路在BMSCs充填的PEDOT對外周神經(jīng)損傷的作用在BMSC向神經(jīng)組織誘導(dǎo)分化過程中,miR-21和Notch信號的通路均為可能的重要促進機制。干擾或抑制二者的功能將顯著影響神經(jīng)功能的恢復(fù)。以上結(jié)果對PEDOT神經(jīng)導(dǎo)管的下一步臨床應(yīng)用具有重要的借鑒價值。
[Abstract]:A new type of acellular muscle scaffold was prepared by chemical method . Objective : To investigate the effect of PEDOT artificial cannula ( PEDOT ) on peripheral nerve injury . The results showed that the expression of miR - 21 and nerve conduction velocity were significantly higher in group C ( control ) than in group A . The results showed that the expression of miR - 21 and nerve conduction velocity were significantly higher in group A ( control ) .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R688

【參考文獻】

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1 Qi Guo;Yusi Chen;Lijuan Guo;Tiejian Jiang;Zhangyuan Lin;;miR-23a/b regulates the balance between osteoblast and adipocyte differentiation in bone marrow mesenchymal stem cells[J];Bone Research;2016年02期

2 Jen-Hua Chuang;Li-Chu Tung;Yenshou Lin;;Neural differentiation from embryonic stem cells in vitro : An overview of the signaling pathways[J];World Journal of Stem Cells;2015年02期

3 David J Gerth;Jun Tashiro;Seth R Thaller;;Clinical outcomes for Conduits and Scaffolds in peripheral nerve repair[J];World Journal of Clinical Cases;2015年02期

4 Defeng Zou;Yi Chen;Yaxin Han;Chen Lv;Guanjun Tu;;Overexpression of microRNA-124 promotes the neuronal differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J];Neural Regeneration Research;2014年12期

5 宋宇;劉佳梅;薛輝;張秀英;田曉巍;;攜帶神經(jīng)干細(xì)胞肌基膜管組織工程支架中神經(jīng)干細(xì)胞的存活分化[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2010年47期

6 時宿妹;張越;張傳宇;孫奮勇;;2種微小RNA實時定量PCR檢測方法的比較[J];生物技術(shù)通訊;2010年03期

7 趙富強;張培訓(xùn);姜保國;;周圍神經(jīng)斷端橋接后數(shù)量放大效應(yīng)的研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2007年15期

8 ;Study on the adoption of Schwann Cell Phenotype by Bone Marrow Stromal Cells in vitro and in vivo[J];Biomedical and Environmental Sciences;2005年05期

9 李劍,姜保國,張殿英,張宏波,黨育,尚永剛,楊明;生物套管小間隙橋接修復(fù)周圍神經(jīng)的實驗研究[J];中華手外科雜志;2003年02期

10 唐杞衡,姜保國,任俠飛,張宏波;甲殼質(zhì)生物套管膜與許旺細(xì)胞生物相容性的實驗研究[J];中華顯微外科雜志;2003年02期

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本文編號：1718323