本文選題：乳腺癌骨轉(zhuǎn)移　切入點：微小RNA-124(miR-124)　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：【研究背景及目的】乳腺癌是我國女性中最常見的惡性腫瘤。盡管隨著診斷和治療水平的發(fā)展,早期乳腺癌更容易得到診斷,并已有標(biāo)準(zhǔn)的治療選擇,生存率也有所提高。然而,晚期乳腺癌患者常發(fā)生局部進(jìn)展或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,目前仍無公認(rèn)的治療標(biāo)準(zhǔn),生存期亦未得到顯著改善。乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移最常見的部位是骨。骨轉(zhuǎn)移可引起骨痛、病理性骨折、脊髓壓迫等骨相關(guān)事件(skeletal related events,SREs),嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和總體預(yù)后。目前,除了化療、內(nèi)分泌治療和分子靶向治療等全身治療以及手術(shù)治療和放療等局部治療以外,骨調(diào)節(jié)藥物(bone modifying agents)因可發(fā)揮預(yù)防和治療骨轉(zhuǎn)移相關(guān)事件的作用,已在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的治療中占據(jù)重要地位。然而,骨調(diào)節(jié)藥物并不能預(yù)防乳腺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移,亦沒有證據(jù)證實其可延長患者生存時間。因此,深入研究發(fā)生乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的機(jī)制,尋找新的治療靶點,將有助于進(jìn)一步改善患者的生存質(zhì)量,延長生存期。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移過程中,腫瘤細(xì)胞經(jīng)過遷移、侵襲、粘附等環(huán)節(jié)到達(dá)骨微環(huán)境后,和骨微環(huán)境中的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨基質(zhì)細(xì)胞之間產(chǎn)生復(fù)雜的相互作用,導(dǎo)致成骨/破骨平衡打破,形成了主要表現(xiàn)為溶骨性病變的病灶,引發(fā)骨相關(guān)事件。在以上過程中,許多發(fā)揮調(diào)控作用的基因或分子表達(dá)出現(xiàn)異常,可能成為新的作用靶點或診斷標(biāo)志物,微小RNA(micro RNA,mi RNA)就是其中的研究熱點之一。作為基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要元件之一,mi RNA可通過作用于與乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或骨微環(huán)境中的重要細(xì)胞因子或趨化因子促進(jìn)或抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生。作為內(nèi)源存在的非編碼雙鏈RNA,mi RNA具有一定的組織特異性和分子靶向性,通過外源性調(diào)控相關(guān)mi RNA表達(dá)可能比傳統(tǒng)的放化療更安全,可能成為治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的新手段,具有良好的應(yīng)用前景。mi R-124最早在小鼠腦組織中被克隆,隨后被證實在人胚胎干細(xì)胞中亦有表達(dá)。作為腦組織中表達(dá)量最高的mi RNA之一,已有許多研究表明mi R-124主要參與了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育,其表達(dá)異常與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)。近來有越來越多的研究關(guān)注mi R-124在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。有研究表明mi R-124在乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、白血病等多種惡性腫瘤中表達(dá)異常,并通過靶向作用于多個癌基因發(fā)揮抑制腫瘤惡性生物學(xué)行為的作用。其中有數(shù)個研究證實mi R-124可抑制乳腺癌的增殖、遷移和侵襲,提示其在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。但目前為止,關(guān)于mi R-124在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用尚未見報道。因此,本課題旨在明確mi R-124在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生中的作用,并初步探討其作用機(jī)制,為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的治療提供新的靶點�！緦嶒灧椒ā恳弧i R-124在不同骨轉(zhuǎn)移能力乳腺癌細(xì)胞及小鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)1、比較正常乳腺組織和不同轉(zhuǎn)移能力乳腺癌細(xì)胞中mi R-124表達(dá)分離正常小鼠乳腺組織,抽取RNA。培養(yǎng)不同骨轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細(xì)胞株BT549、MDA-MB-231、Hs578t、MDA-MB-468、MDA-MB-436、MCF7、T47D、BT474,抽取細(xì)胞總RNA。Real-time PCR法檢測以上組織和細(xì)胞中mi R-124的表達(dá)情況。2、檢測并比較母代乳腺癌細(xì)胞和小鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中mi R-124表達(dá)小鼠左心室注射熒光素酶標(biāo)記的MDA-MB-231制備乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型�；铙w成像儀監(jiān)測小鼠在體熒光信號。待發(fā)生骨轉(zhuǎn)移后處死小鼠,留取骨轉(zhuǎn)移組織,抽取RNA。Real-time PCR法檢測以上組織和母代MDA-MB-231細(xì)胞中mi R-124的表達(dá)情況。3、檢測人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中mi R-124表達(dá),分析其與患者無轉(zhuǎn)移生存期關(guān)系收集5例乳腺癌患者原發(fā)癌組織、癌旁組織和骨轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本,原位雜交法檢測mi R-124表達(dá),比較各組表達(dá)差異。收集20例人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本,抽取總RNA,Real-time PCR法檢測mi R-124的表達(dá)情況。通過隨訪了解患者從發(fā)現(xiàn)原發(fā)癌到發(fā)現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移灶的時間,即無骨轉(zhuǎn)移生存期(Bone metastasis free survival),分析mi R-124表達(dá)與患者無骨轉(zhuǎn)移生存期的相關(guān)性。二、體外調(diào)控乳腺癌細(xì)胞mi R-124表達(dá)對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的作用1、上調(diào)乳腺癌細(xì)胞mi R-124表達(dá)或抑制其作用對骨髓來源的巨噬細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的影響乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的mi R-124擬似物(mi R-124 mimic)及陰性對照(negative control,NC)或mi R-124競爭性抑制物(mi R-124 inhibitor)及陰性對照(inhibitor NC),收取轉(zhuǎn)染后48小時培養(yǎng)上清。從小鼠股骨分離骨髓來源巨噬細(xì)胞(bone marrow derived macrophage,BMM)作為破骨細(xì)胞前體細(xì)胞,利用上述各組腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清培養(yǎng)BMM細(xì)胞,6天后進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色明確破骨細(xì)胞分化情況。2、改變?nèi)橄侔┘?xì)胞mi R-124表達(dá)對成骨細(xì)胞RANKL和OPG表達(dá)影響MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-124 mimic及NC或mi R-124 inhibitor及inhibitor NC,轉(zhuǎn)染后48小時收取上清。利用各組上清分別培養(yǎng)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞株3T3E1細(xì)胞,6天后提取不同上清培養(yǎng)組3T3E1細(xì)胞的RNA,Real-time PCR法檢測其中RANKL和OPG表達(dá)。3、上調(diào)乳腺癌細(xì)胞mi R-124表達(dá)對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相互作用的影響MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-124 mimic及NC。上述各組乳腺癌細(xì)胞分別和3T3E1細(xì)胞共培養(yǎng),3天后收集各組培養(yǎng)上清,利用該上清培養(yǎng)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞株RAW264.7,培養(yǎng)3天后提取各組細(xì)胞的RNA,Real-time PCR法檢測其中與破骨細(xì)胞分化相關(guān)的指標(biāo)TRAP、c-Src、NFATc1和c-fos表達(dá)。三、初步探討mi R-124在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制1、利用軟件預(yù)測并篩選mi R-124與骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因利用Target Scan軟件預(yù)測mi R-124靶基因,并篩選其中與骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因,發(fā)現(xiàn)白介素11(Interleukin 11,IL11)為其潛在靶基因。2、明確mi R-124對IL11表達(dá)的影響MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-124 mimic或inhibitor,Real-time PCR法檢測IL11m RNA表達(dá),Western blot檢測其蛋白表達(dá)。3、驗證mi R-124與IL11 3′端非翻譯區(qū)(3′-untranslated region,3′-UTR)的靶向結(jié)合作用構(gòu)建含有mi R-124結(jié)合位點的IL11 3′-UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒及該位點突變的報告基因質(zhì)粒,與mi R-124 mimic或NC共轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞,雙報告基因試劑盒檢測報告基因質(zhì)粒熒光素酶活性,明確mi R-124是否可通過結(jié)合IL11 3′-UTR靶向調(diào)控IL11的表達(dá)。4、驗證IL11和mi R-124在乳腺癌細(xì)胞及乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)的相關(guān)性(1)正常乳腺組織和不同轉(zhuǎn)移能力乳腺癌細(xì)胞中IL11和mi R-124表達(dá)相關(guān)性Real-time PCR法檢測正常小鼠乳腺組織和乳腺癌細(xì)胞株BT549、MDA-MB-231、Hs578t、MDA-MB-468、MDA-MB-436、MCF7、T47D、BT474中IL11的表達(dá)情況,分析其與mi R-124表達(dá)是否存在負(fù)相關(guān)。(2)母代乳腺癌細(xì)胞和小鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中IL11和mi R-124表達(dá)相關(guān)性Real-time PCR法檢測MDA-MB-231細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移模型小鼠標(biāo)本和母代MDA-MB-231細(xì)胞中IL11的表達(dá)情況,分析其與mi R-124表達(dá)的相關(guān)性。(3)人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中IL11和mi R-124表達(dá)相關(guān)性收集5例乳腺癌患者原發(fā)癌組織、癌旁組織和骨轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本,免疫組化法檢測IL11表達(dá),分析其與mi R-124表達(dá)相關(guān)性。收集20例人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本,抽取總RNA,Real-time PCR法檢測IL11的表達(dá)情況,分析其與mi R-124表達(dá)的相關(guān)性。四、統(tǒng)計學(xué)處理若無特殊說明,實驗進(jìn)行生物學(xué)重復(fù)3次,每次3個復(fù)孔。數(shù)據(jù)以X±SD,即均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計檢驗。方差齊性的兩組之間比較采用student t檢驗(Student's t test),方差非齊性則采用非參數(shù)檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。通過統(tǒng)計檢驗計算P值,P0.05為具有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異。【實驗結(jié)果】一、mi R-124在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞及小鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)下調(diào)1、mi R-124在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),且在骨轉(zhuǎn)移能力較高的乳腺癌細(xì)胞株中表達(dá)較低Real-time PCR結(jié)果顯示,與正常小鼠乳腺組織相比,乳腺癌細(xì)胞中mi R-124表達(dá)顯著下調(diào),且其在骨轉(zhuǎn)移性較高的三陰(雌激素受體、孕激素受體和HER2均為陰性)乳腺癌細(xì)胞株BT549、MDA-MB-231、Hs578t、MDA-MB-468、MDA-MB-436中表達(dá)較骨轉(zhuǎn)移性低的細(xì)胞株MCF7、T47D、BT474低。2、小鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中mi R-124表達(dá)下調(diào)小鼠左心室注射MDA-MB-231細(xì)胞制備乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型。Real-time PCR結(jié)果顯示,與母代MDA-MB-231細(xì)胞相比,小鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中的mi R-124表達(dá)量顯著下調(diào)。3、人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中mi R-124表達(dá)下調(diào),且其表達(dá)與患者無骨轉(zhuǎn)移生存期相關(guān)原位雜交法檢測乳腺癌患者原發(fā)癌組織、癌旁組織和骨轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本mi R-124表達(dá),結(jié)果顯示與原發(fā)癌旁組織相比,人乳腺癌組織中mi R-124表達(dá)明顯減少,在骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本中表達(dá)進(jìn)一步減少。檢測20例人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本中mi R-124表達(dá)并隨訪患者臨床過程后發(fā)現(xiàn)mi R-124表達(dá)低者無骨轉(zhuǎn)移生存期較mi R-124表達(dá)高者短。二、體外調(diào)控乳腺癌細(xì)胞mi R-124表達(dá)可直接或通過成骨細(xì)胞促進(jìn)破骨細(xì)胞分化1、上調(diào)乳腺癌細(xì)胞mi R-124表達(dá)抑制BMM細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞,抑制mi R-124作用促進(jìn)BMM細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-124 mimic或NC后收集上清培養(yǎng)BMM細(xì)胞,TRAP染色結(jié)果顯示mi R-124 mimic組破骨細(xì)胞分化較對照組顯著減少。反之,MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-124 inhibitor或inhibitor NC后收集上清培養(yǎng)BMM細(xì)胞,TRAP染色結(jié)果顯示mi R-124 inhibitor組破骨細(xì)胞分化較對照組顯著增加。2、上調(diào)乳腺癌細(xì)胞mi R-124表達(dá)增加成骨細(xì)胞OPG/RANKL比值,抑制mi R-124作用降低成骨細(xì)胞OPG/RANKL比值MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-124 mimic或NC后收集上清培養(yǎng)3T3E1細(xì)胞,Real-time PCR結(jié)果顯示mi R-124 mimic上清組3T3E1細(xì)胞中OPG與RANKL比值增加。反之,MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-124 inhibitor或inhibitor NC后收集上清培養(yǎng)3T3E1細(xì)胞,Real-time PCR結(jié)果顯示mi R-124 inhibitor上清組3T3E1細(xì)胞中OPG與RANKL比值降低。3、上調(diào)乳腺癌細(xì)胞mi R-124表達(dá)抑制成骨細(xì)胞促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的能力MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-124 mimic或NC后分別和3T3E1細(xì)胞共培養(yǎng),收上清培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞,Real-time PCR結(jié)果顯示mi R-124 mimic組上清培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞中與破骨細(xì)胞分化相關(guān)的指標(biāo)TRAP、c-Src、NFATc1和c-fos表達(dá)顯著下調(diào)。三、mi R-124部分通過調(diào)控IL11抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移1、mi R-124抑制IL11 m RNA和蛋白表達(dá)MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染mi R-124 mimic或inhibitor,Real-time PCR結(jié)果顯示mi R-124 mimic抑制IL11 m RNA表達(dá),mi R-124 inhibitor增加IL11 m RNA表達(dá);Western blot結(jié)果顯示mi R-124 mimic抑制IL11蛋白表達(dá),mi R-124 inhibitor促進(jìn)IL11蛋白表達(dá)。2、mi R-124靶向結(jié)合IL11 3′-UTR構(gòu)建IL11 3′-UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒,與mi R-124 mimic或NC共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞,雙報告基因試劑盒檢測結(jié)果顯示mi R-124 mimic可抑制該報告基因活性;將IL11 3′-UTR上mi R-124結(jié)合位點突變,重復(fù)上述實驗,雙報告基因試劑盒檢測結(jié)果顯示位點突變后,mi R-124 mimic對報告基因的作用消失。以上結(jié)果提示mi R-124可通過結(jié)合IL11 3′-UTR靶向調(diào)控IL11的表達(dá)。3、IL11和mi R-124在乳腺癌細(xì)胞及乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(1)正常乳腺組織和不同轉(zhuǎn)移能力乳腺癌細(xì)胞中IL11和mi R-124表達(dá)呈負(fù)相關(guān)Real-time PCR法檢測正常小鼠乳腺組織和乳腺癌細(xì)胞株BT549、MDA-MB-231、Hs578t、MDA-MB-468、MDA-MB-436、MCF7、T47D、BT474中IL11的表達(dá)情況,相關(guān)性分析結(jié)果顯示IL11與mi R-124表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。(2)小鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中IL11和mi R-124表達(dá)呈負(fù)相關(guān)Real-time PCR法檢測MDA-MB-231細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移模型小鼠標(biāo)本和母代MDA-MB-231細(xì)胞中中IL11的表達(dá)情況,相關(guān)性分析結(jié)果顯示IL11與mi R-124表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。(3)人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中IL11和mi R-124表達(dá)相關(guān)性免疫組化法檢測乳腺癌患者原發(fā)癌組織、癌旁組織和骨轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本IL11表達(dá),結(jié)果顯示與原發(fā)癌旁組織相比,人乳腺癌組織中IL11表達(dá)明顯增加,在骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本中表達(dá)進(jìn)一步增加。收集20例人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本,Real-time PCR及相關(guān)性分析結(jié)果顯示其中IL11的表達(dá)與mi R-124表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)�！窘Y(jié)論】一、mi R-124乳腺癌細(xì)胞和乳腺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本中表達(dá)下調(diào),并與患者無轉(zhuǎn)移生存期密切相關(guān),提示其在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。二、乳腺癌細(xì)胞中mi R-124可抑制破骨細(xì)胞分化和活化。三、mi R-124靶向調(diào)控乳腺癌細(xì)胞中IL11表達(dá),可能為其抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;miR-124 suppresses multiple steps of breast cancer metastasis by targeting a cohort of pro-metastatic genes in vitro[J];癌癥;2011年12期

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本文編號：1700257