本文選題：鎂合金　切入點(diǎn)：生物相容性　出處：《鄭州大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：背景與目的頸椎前路椎間融合內(nèi)固定術(shù)(anterior cervical discectomy and fusion,ACDF)長久以來一直是治療頸椎疾病的傳統(tǒng)術(shù)式。雖然前路固定鋼板增強(qiáng)了頸椎穩(wěn)定性,但諸如咽喉部異物感、吞咽障礙、鋼板松動(dòng)脫落甚至刺傷食管等內(nèi)固定物并發(fā)癥時(shí)有報(bào)道[1,2]。為了解除傳統(tǒng)鈦合金固定鋼板的潛在危險(xiǎn),國內(nèi)外越來越多的學(xué)者將目光轉(zhuǎn)向生物可吸收材料的研究上。近年來鎂合金因其在彈性模量、體內(nèi)代謝方面的優(yōu)勢成為了新型內(nèi)固定材料的研究熱點(diǎn)。生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)鎂合金頸前路鋼板與傳統(tǒng)鈦合金鋼板具有相似的力學(xué)特性[3,4]。本研究參照國際標(biāo)準(zhǔn)ISO10993-5與ISO10993-12利用MG-63細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn),并觀察MG-63細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白(collagen typeⅠ,Col-1)、骨鈣素(osteocalcin,OC)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)等成骨因子的表達(dá)變化以及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性以探討鎂合金前路鋼板的生物相容性以及其對(duì)成骨過程的影響。材料與方法按照ISO10993-12將Mg 2wt%Zn合金(由鄭州大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院提供)制備成不同濃度的浸提液(未稀釋時(shí)質(zhì)量體積比為0.2g/ml)。MG-63細(xì)胞復(fù)蘇后加入培養(yǎng)液,靜置于37℃、5%CO2飽和95%濕度條件下培養(yǎng)。將實(shí)驗(yàn)分為2組,空白對(duì)照組:使用未處理的培養(yǎng)基;實(shí)驗(yàn)組:使用不同稀釋倍數(shù)的鎂合金浸提液培養(yǎng)基。觀察細(xì)胞形態(tài)定期更換培養(yǎng)液。使用不同稀釋倍數(shù)的浸提液處理細(xì)胞,于第1,2,3天采用CCK-8法檢測各組內(nèi)光吸收值(OD)以評(píng)估細(xì)胞增殖活性。在10倍稀釋濃度浸提液處理后的第1、3、5、7、9天,以及不同稀釋倍數(shù)的浸提液處理后第5天,采用可見光比色法測定細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性。于干預(yù)后第5天裂解細(xì)胞利用BCA蛋白試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)蛋白總量。同時(shí)提取蛋白質(zhì)與RNA并采用免疫蛋白印跡技術(shù)(western-blot)與實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(real-time quantitative PCR)檢測目標(biāo)蛋白Col-1、OC、OPN與相關(guān)RNA的表達(dá)量,評(píng)估鎂合金對(duì)MG-63細(xì)胞成骨能力的影響。結(jié)果1各實(shí)驗(yàn)組CCK-8檢測結(jié)果實(shí)驗(yàn)組在1x與2.5x稀釋濃度條件下細(xì)胞生存率明顯小于10x以上稀釋濃度組,差異值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。10x稀釋濃度以上分組的細(xì)胞生存率與空白對(duì)照組差異值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。根據(jù)CCK-8結(jié)果計(jì)算72小時(shí)IC50約等于5x稀釋濃度�？赏茰y出滲透壓和鎂離子濃度與細(xì)胞生存率呈負(fù)相關(guān),即滲透壓和鎂離子濃度越高,細(xì)胞毒性越大。2各實(shí)驗(yàn)組ALP活性檢測結(jié)果以不同稀釋倍數(shù)的鎂合金浸提液培養(yǎng)MG-63細(xì)胞1、3、5、7、9天后,隨著培養(yǎng)時(shí)間延長,實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組的細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶表達(dá)均呈上升趨勢,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)堿性磷酸酶表達(dá)均有顯著差異(P0.05)。同一時(shí)間點(diǎn)不同稀釋倍數(shù)的堿性磷酸酶表達(dá)均有顯著差異(P0.05)。鎂合金浸提液對(duì)ALP的表達(dá)有抑制效應(yīng),且隨著稀釋倍數(shù)的增大該效應(yīng)逐漸減弱。3各實(shí)驗(yàn)組蛋白總量檢測結(jié)果在干預(yù)第5天時(shí),不同稀釋濃度組的蛋白總量均小于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),鎂合金浸提液對(duì)蛋白總量的表達(dá)有抑制效應(yīng),且隨著稀釋倍數(shù)的增大該效應(yīng)逐漸減弱。4各實(shí)驗(yàn)組成骨相關(guān)基因表達(dá)檢測結(jié)果管家基因GAPDH及目的基因Col-1、OC和OPN m RNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線可。各個(gè)檢測基因均獲得較好的Ct值,且樣品重復(fù)性好。實(shí)驗(yàn)組Col-1、OC與OPN的m RNA的表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5各實(shí)驗(yàn)組Col-1、OC、OPN蛋白表達(dá)檢測結(jié)果以不同稀釋倍數(shù)的鎂合金浸提液培養(yǎng)MG-63細(xì)胞,于第5天裂解細(xì)胞收集蛋白。利用蛋白印跡法(western blot)對(duì)細(xì)胞內(nèi)Col-1、OC、OPN進(jìn)行檢測。通過圖像分析軟件對(duì)兩組的圖片進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)組Col-1、OC、OPN的表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。這種促進(jìn)效應(yīng)隨著稀釋倍數(shù)的增高而逐漸降低(P0.05)。結(jié)論1.高濃度的鎂合金浸提液對(duì)MG-63細(xì)胞的增殖有抑制作用;2.Mg-Zn合金可以促進(jìn)MG-63細(xì)胞成骨因子(Col-1、OC、OPN)表達(dá),可提高M(jìn)G-63細(xì)胞的成骨能力。
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本文編號(hào)：1676917