本文選題：缺血再灌注　切入點(diǎn)：腸上皮屏障　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：背景:腸缺血再灌注(Ischemia Reperfusion,I/R)損傷是造成腸屏障功能衰竭(Intestinal Barrier Failure,IBF)的常見誘因,可導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞(Intestinal Epithelial Cells,IEC)剝脫,粘膜通透性增加,腸內(nèi)細(xì)菌移位,繼發(fā)腸源性感染,最終導(dǎo)致多器官衰竭(Multiple Organ Failure,MOF)。而存在于相鄰的腸上皮細(xì)胞膜間的緊密連接(Tight Junctions,TJs)則是組成腸上皮屏障(Intestinal Epithelial Barrier,IEB)的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),它調(diào)控細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸,建立細(xì)胞極性,抵御外來病原微生物入侵,對IEB的維持具有至關(guān)重要的作用。研究表明,芳香烴受體(Aryl Hydrocarbon Receptor,AhR)對腸道免疫屏障(Intestinal Immunologic Barrier,IIB)的維持發(fā)揮重要作用。AhR活化可調(diào)節(jié)腸上皮間淋巴細(xì)胞的亞群及分布,上調(diào)抑炎因子IL-10、IL-22等的表達(dá),下調(diào)促炎因子IFN-γ、TNF-α等的表達(dá),顯著緩解動物實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎癥狀。而其對IEB功能的作用及機(jī)制迄今仍不十分清楚。Notch1作為AhR調(diào)控的下游基因群(Gene Battery)中的一員已被證實(shí)。同時(shí),Notch1信號通路對IEB的維持及TJ蛋白的表達(dá)具有重要作用也有文獻(xiàn)報(bào)道。由于AhR及其下游Notch1均表達(dá)于IEC,因此我們推測,AhR活化對IEB具有保護(hù)作用,且AhR-Notch1信號通路調(diào)控TJ蛋白的表達(dá)可能是其維持IEB功能的潛在機(jī)制。本文擬通過建立體內(nèi)腸I/R模型及體外Caco-2細(xì)胞缺氧(Hypoxia)模型,應(yīng)用Western Blot、Realtime-qPCR、免疫組化、免疫熒光、跨上皮電阻(Trans-epithelium Electrical Resistant,TER)檢測等技術(shù),檢測AhR-Notch1信號通路相關(guān)分子的表達(dá),TJ蛋白(ZO-1,Occludin)的表達(dá)及腸粘膜通透性的變化,探討AhR活化如何參與并調(diào)控IEB功能,并闡明其中的作用機(jī)制,為臨床腸I/R損傷的預(yù)防、治療以及IEB功能的維持提供新的理論依據(jù)和靶點(diǎn)。方法:1、建立小鼠腸I/R模型,應(yīng)用HE染色、腸粘膜損傷邱氏評分(Chius’Score)、尤斯灌流小室系統(tǒng)(Ussing Chambers)檢測TER等方法,觀察各組小鼠腸粘膜損傷情況以及腸上皮通透性變化。2、應(yīng)用免疫組化、Western Blot等技術(shù),觀察各組小鼠腸粘膜TJ蛋白(ZO-1,Occludin)的表達(dá)及分布的變化。3、應(yīng)用免疫組化、Realtime-qPCR、Western Blot等技術(shù),觀察各組小鼠腸粘膜AhR-Notch1信號通路相關(guān)分子的表達(dá)、分布以及活性的變化。4、構(gòu)建體外Caco-2細(xì)胞缺氧模型,模擬體內(nèi)I/R損傷,應(yīng)用免疫熒光、Western Blot等技術(shù),觀察缺氧條件下,AhR活化對下游Notch1信號通路相關(guān)分子的表達(dá)及活性情況。5、應(yīng)用免疫熒光、Western Blot、電阻儀檢測TER等技術(shù),進(jìn)一步觀察缺氧條件下,AhR活化對各組細(xì)胞TJ蛋白(ZO-1,Occludin)的表達(dá)以及對膜通透性的影響。6、應(yīng)用Western Blot技術(shù),觀察缺氧條件下,同時(shí)給予Notch1信號阻斷劑DAPT和AhR激動劑Ficz,各組細(xì)胞AhR-Notch1通路相關(guān)蛋白及TJ蛋白(ZO-1,Occludin)的表達(dá)變化。主要結(jié)果:1、小鼠腸I/R模型中,IEC正常組織結(jié)構(gòu)被破壞:絨毛倒伏、斷裂、充血水腫、脫落;邱氏組織學(xué)損傷評分增加;腸粘膜TER下降,通透性增加。腹腔注入AhR激動劑Ficz可明顯緩解腸I/R所致粘膜損傷及IEB的破壞。2、小鼠腸I/R模型中,TJ蛋白(ZO-1,Occludin)的連續(xù)性中斷,表達(dá)下降。注入Ficz可使被破壞的TJ蛋白(ZO-1,Occludin)的分布及表達(dá)有所恢復(fù)。3、小鼠腸I/R模型中,AhR-Notch1通路相關(guān)蛋白表達(dá)減弱。而注入Ficz可顯著上調(diào)它們的表達(dá)及活性。4、體外Caco-2細(xì)胞缺氧模型中,AhR-Notch1通路相關(guān)蛋白表達(dá)同樣減弱;TJ蛋白(ZO-1,Occludin)的形態(tài)破壞,表達(dá)減弱;TER下降。Ficz活化的AhR可促進(jìn)Notch1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá);并維持了TJ蛋白(ZO-1,Occludin)的表達(dá)及分布;緩解了缺氧所致IEB功能障礙。5、體外Caco-2缺氧模型中,應(yīng)用DAPT阻斷下游Notch1通路不影響Ficz對AhR的活化作用;但其可阻斷Ficz對TJ蛋白(ZO-1,Occludin)的上調(diào)作用。結(jié)論:1、AhR活化能夠通過調(diào)控腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1、Occludin的表達(dá)顯著緩解腸粘膜通透性的增加,從而發(fā)揮其對腸上皮屏障的保護(hù)作用。2、AhR活化對下游Notch1信號通路的調(diào)控是AhR調(diào)控緊密連接蛋白表達(dá)的潛在機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R61

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