本文選題：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞　切入點(diǎn)：長(zhǎng)鏈非編碼RNA　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文

【摘要】：研究背景脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose Tissue-Derived Stem Cell,ADSC)是從脂肪組織中分離出來(lái)的一種中胚層來(lái)源的多能干細(xì)胞。因其具有來(lái)源充足、取材方便、易于培養(yǎng)、多向分化和免疫調(diào)節(jié)等眾多優(yōu)點(diǎn),已成為間充質(zhì)干細(xì)胞研究與應(yīng)用的熱點(diǎn)。ADSC可用于多種組織器官的損傷修復(fù)和再生,例如用于皮膚、骨與軟骨、肌腱與韌帶、周圍神經(jīng)等組織的損傷修復(fù)等。ADSC的增殖、多向分化、向損傷部位遷移等生物學(xué)特性是影響其發(fā)揮損傷修復(fù)功能的關(guān)鍵因素。應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cell,MSC)治療組織損傷時(shí),往往是在炎癥環(huán)境中發(fā)揮其損傷修復(fù)的功能,炎癥因子將影響MSC的生物學(xué)特性進(jìn)而影響其組織修復(fù)與再生功能。因此,炎癥環(huán)境下ADSC生物學(xué)特性的改變和調(diào)節(jié)也受到越來(lái)越多的關(guān)注。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long Noncoding RNA,lncRNA)在調(diào)控干細(xì)胞基因表達(dá)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中扮演著重要的角色。lncRNA-ANCR/DANCR(Anti-differetiationNoncodingRNA,ANCR)在人體多種組織中廣泛表達(dá),并在不同組織來(lái)源的干細(xì)胞中發(fā)揮著不同的調(diào)節(jié)作用。例如研究發(fā)現(xiàn)ANCR可以抑制表皮分化,抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell,BMSC)的成骨分化以及牙體組織來(lái)源干細(xì)胞(Dental Tissue-Derived Stem Cell,DTSC)的成脂、成骨和成神經(jīng)分化,卻促進(jìn)滑膜組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(Synovium-Derived MSC,SMSC)的增殖和成軟骨分化。ANCR對(duì)人ADSC(hADSC)生物學(xué)特性的影響還尚未見(jiàn)報(bào)道。此外,我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)與炎癥密切相關(guān)的地塞米松促進(jìn)ANCR在hADSC中的表達(dá),猜測(cè)ANCR可能也會(huì)受到微環(huán)境中炎癥因子的調(diào)控。因此,篩選影響ANCR表達(dá)的炎癥因子后,我們應(yīng)用地塞米松和TNF-α刺激hADSC,觀察ANCR在hADSC生物學(xué)特性發(fā)生改變過(guò)程中的作用,并初步探討了相關(guān)機(jī)制。本研究豐富了炎癥環(huán)境下hADSC生物學(xué)特性發(fā)生改變的相關(guān)機(jī)制的研究,為hADSC在組織損傷中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。研究目的1.探討ANCR對(duì)hASC增殖、周期、凋亡、遷移以及成脂、成骨分化等生物學(xué)特性的調(diào)控作用。2.檢測(cè)地塞米松對(duì)hADSC中ANCR表達(dá)水平的影響,探討ANCR在地塞米松誘導(dǎo)的hADSC細(xì)胞生物學(xué)特性改變中發(fā)揮的作用。3.篩選影響hADSC中ANCR表達(dá)的炎癥因子,探討ANCR在TNF-α誘導(dǎo)的hADSC細(xì)胞生物學(xué)特性改變中發(fā)揮的作用。4.初步探討TNF-α、地塞米松調(diào)控hADSC中ANCR表達(dá)的機(jī)制。研究方法1.ANCR對(duì)hADSC生物學(xué)特性的影響從抽脂術(shù)后廢棄的脂肪組織中獲取血管基質(zhì)成分SVF(Stromal Vascular Fraction),并用干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸后貼壁培養(yǎng)獲得hADSC。流式分析儀對(duì)P3代hADSC進(jìn)行表面標(biāo)志物的檢測(cè)。構(gòu)建ANCR的敲減與過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,利用慢病毒感染的方式敲減和過(guò)表達(dá)hADSC中的ANCR后,CCK-8法檢測(cè)hADSC增殖、Muse細(xì)胞狀態(tài)分析儀檢測(cè)細(xì)胞周期、Annexin-V和7-AAD染色之后用Muse細(xì)胞狀態(tài)分析儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平的變化、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的改變、成脂誘導(dǎo)后7天進(jìn)行油紅O染色鑒定成脂效果、成骨誘導(dǎo)后14天進(jìn)行茜素紅染色鑒定成骨效果。此外,采用Real-time PCR檢測(cè)ANCR敲減以及過(guò)表達(dá)之后hADSC中增殖相關(guān)基因(C-FOS,C-JUN)、周期調(diào)控基因(P53,P21,CHEK1)、細(xì)胞凋亡調(diào)控基因(Caspase8,Caspase3,NF-κB,Bcl-2)、趨化因子受體(CXCR4,CXCR7)、成脂分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子、脂類合成酶基因以及成骨分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子等的表達(dá)。2.地塞米松對(duì)hADSC生物學(xué)特性的影響以及ANCR在其中的作用體外添加1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L三種濃度的地塞米松處理hADSC后,檢測(cè)hADSC的增殖、周期、凋亡、遷移等生物學(xué)特性的改變,以及Real-time PCR 檢測(cè)各組 hADSC 中 ANCR、成脂相關(guān)基因(PARy,C/EBPα)、成骨相關(guān)基因(RUNX2,ALP)、增殖、周期、凋亡相關(guān)基因以及趨化因子受體(CXCR4,CXCR7)的表達(dá)。將hADSC中ANCR敲減后添加1×10-7mol/L的地塞米松處理并檢測(cè)hADSC增殖、周期和遷移的改變,Real-timePCR檢測(cè)增殖、周期相關(guān)基因以及趨化因子受體CXCR4與CXCR7的表達(dá)。3.TNF-α對(duì)hADSC生物學(xué)特性的影響以及ANCR在其中的作用體外分別添加TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6、IL-8、MCP-1六種促炎因子以及IL-13、IL-10兩種抑炎因子,Real-time PCR檢測(cè)hADSC中ANCR的表達(dá)。體外添加10ng/ml和50ng/ml的TNF-α處理hADSC后,檢測(cè)hADSC的增殖、周期、凋亡、遷移、成脂、成骨分化等生物學(xué)特性的改變,以及Real-timePCR檢測(cè)各組hADSC中增殖、周期、凋亡、遷移、成脂以及成骨相關(guān)基因的表達(dá)。在hADSC中過(guò)表達(dá)ANCR后添加10 ng/ml TNF-α刺激并檢測(cè)hADSC增殖、周期和遷移的改變,Real-time PCR檢測(cè)增殖、周期和遷移相關(guān)基因的表達(dá)。4.TNF-α、地塞米松調(diào)控hADSC中ANCR表達(dá)的機(jī)制10 ng/ml TNF-α刺激hADSC,不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,Western Blot檢測(cè)NF-κB(Nuclear factor κB)和 mTOR(Mammalian Target of Rapamycin)信號(hào)通路活化情況。分別應(yīng)用NF-κB通路的抑制劑BAY11-7082、地塞米松以及mTOR通路抑制劑雷帕霉素(Rapamycin)和PP242預(yù)處理hADSC,再加入10 ng/ml TNF-α刺激后,Western Blot檢測(cè)相應(yīng)信號(hào)通路是否被抑制以及Real-time PCR檢測(cè)ANCR的表達(dá)水平。研究結(jié)果1.ANCR對(duì)hADSC生物學(xué)特性的影響P3代hADSC中,MSC表面標(biāo)志分子CD44、CD73、CD90、CD105等的表達(dá)均在95%以上,CD45等造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)為陰性。敲減ANCR促進(jìn)hADSC的增殖,增加S期的細(xì)胞比例、降低G0/G1期的細(xì)胞比例,促進(jìn)hADSC的遷移以及成脂、成骨分化。過(guò)表達(dá)ANCR抑制hADSC的增殖,降低S期的細(xì)胞比例、增加G0/G1期的細(xì)胞比例,抑制hADSC的遷移以及成脂、成骨分化。敲減和過(guò)表達(dá)ANCR對(duì)hADSC的細(xì)胞凋亡狀態(tài)都無(wú)顯著影響。2.地塞米松對(duì)hADSC生物學(xué)特性的影響以及ANCR在其中的作用地塞米松促進(jìn)hADSC中ANCR的表達(dá),并且隨著地塞米松濃度的增加而升高。高濃度地塞米松(1×10-6mol/L,1×10-7mol/L)抑制hADSC的增殖,減少S期的細(xì)胞比例、升高G0/G1期細(xì)胞比例,抑制hADSC的遷移,促進(jìn)hADSC的凋亡以及成脂相關(guān)基因PPARγ和C/EBPα的表達(dá)。低濃度地塞米松(1×10-8mol/L)促進(jìn)hADSC中成骨相關(guān)基因RUNX2和ALP的表達(dá),對(duì)hADSC增殖、周期、凋亡以及遷移沒(méi)有顯著的影響。敲減ANCR可以減弱1× 10-7 mol/L地塞米松對(duì)hADSC增殖、周期、遷移的抑制作用。3.TNF-α對(duì)hADSC生物學(xué)特性的影響以及ANCR在其中的作用TNF-α、IL-1β、IFN-y 可以降低 hADSC 中 ANCR 的表達(dá)水平。10 ng/ml 和 50 ng/mlTNF-α促進(jìn)hADSC增殖,增加S期的細(xì)胞比例、降低G0/G1期的細(xì)胞比例,促進(jìn)hADSC中凋亡抑制因子NF-κB的表達(dá)及其凋亡拮抗作用,促進(jìn)hADSC細(xì)胞遷移能力,抑制hADSC成脂、成骨分化。ANCR的過(guò)表達(dá)可以減弱TNF-α對(duì)hADSC細(xì)胞增殖、周期、遷移的促進(jìn)作用。4.TNF-α、地塞米松調(diào)控hADSC中ANCR表達(dá)的機(jī)制TNF-α可以激活hADSC中NF-κB和mTOR信號(hào)通路,NF-κB和mTOR通路的活化可以分別被BAY11-7082、地塞米松以及Rapamycin、PP242抑制。BAY11-7082和地塞米松可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的hADSC中ANCR的下降,并且單獨(dú)作用時(shí)可以通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)hADSC中ANCR的表達(dá),Rapamycin和PP242則無(wú)此作用。研究結(jié)論1.ANCR可以調(diào)控hADSC的增殖、周期、遷移以及成脂、成骨分化能力。2.地塞米松濃度依賴性的促進(jìn)hADSC中ANCR的表達(dá),并且敲減ANCR可以減弱1×10-7mol/L地塞米松對(duì)hADSC增殖、周期以及遷移的抑制作用。提示ANCR可能參與高濃度地塞米松對(duì)hADSC增殖、周期以及遷移的調(diào)控。3.促炎因子TNF-α可以降低hADSC中ANCR的表達(dá),并且ANCR的過(guò)表達(dá)可以減弱TNF-α對(duì)hADSC增殖、周期以及遷移的促進(jìn)作用。提示ANCR可能會(huì)參與TNF-α對(duì)hADSC增殖、周期以及遷移的調(diào)控。推測(cè)ANCR的下降與炎癥環(huán)境下hADSC增殖、遷移能力的變化密切相關(guān)。4.NF-κB信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)ANCR的表達(dá),1×10-7 mol/L地塞米松可以通過(guò)抑制NF-κB通路的激活促進(jìn)hADSC中ANCR的表達(dá),并且可以抑制TNF-α所引起的NF-κB信號(hào)通路的激活來(lái)拮抗TNF-α誘導(dǎo)的ANCR下降。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R62

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8 張猛;血管內(nèi)皮前體細(xì)胞對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞分化潛能的影響[D];石河子大學(xué);2015年

9 馬麗媛;利用MyoD基因誘導(dǎo)綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞的研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

10 宋維文;MicroRNA-133誘導(dǎo)綿羊間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞的研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：1666160