本文選題：成纖維細胞　切入點：凋亡　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：椎板切除術(shù)是脊柱外科最為常用的手術(shù)方式之一,然而椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕粘連嚴重影響了手術(shù)減壓的效果,因此成為一直困擾著脊柱外科醫(yī)生卻沒有得到很好解決的難題。因此,如何有效預(yù)防或減少椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕粘連對于保證術(shù)后療效顯得尤為重要。既往研究已經(jīng)證實,椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕的形成主要是由于局部成纖維細胞異常增殖、過度活化、膠原大量堆積等原因。因此,如何抑制成纖維細胞異常增殖和過度活化成為該領(lǐng)域研究的關(guān)鍵點。目前國內(nèi)外在預(yù)防瘢痕粘連方面,主要進展包括:局部應(yīng)用生物材料阻斷成纖維細胞的浸潤和聚集;局部應(yīng)用抑制成纖維細胞的增殖的藥物;局部應(yīng)用促進成纖維細胞的凋亡的抗腫瘤藥物(如絲裂霉素、他克莫司、雷帕霉素等);以流體或半流體樣物質(zhì)包裹手術(shù)區(qū)域的神經(jīng)根和硬膜以及免疫治療。我們分別研究了絲裂霉素C(MMC-C)和他克莫司(FK506)對硬膜外瘢痕粘連的作用。體內(nèi)、外實驗發(fā)現(xiàn)MMC-C和FK506均可有效抑制成纖維細胞增殖、膠原合成、促進成纖維細胞凋亡,從而顯著地抑制了硬膜外瘢痕的形成。然而局部應(yīng)用MMC-C、FK506對周圍神經(jīng)組織的產(chǎn)生的毒性作用,嚴重限制了這些藥物的臨床應(yīng)用。因此我們急需尋找一種既可以有效抑制疤痕形成,又可以避免生物毒性作用的藥物。�；撬�(2-氨基乙烷亞磺酸)是一種哺乳動物體內(nèi)極為豐富的氨基酸。是功能飲料中一種常見的添加成分。�；撬岵粌H具有調(diào)節(jié)滲透壓、穩(wěn)定細胞膜、調(diào)節(jié)神經(jīng)傳導(dǎo)等生物學(xué)作用,還可以保護細胞免受應(yīng)激誘導(dǎo)的過氧化。近年來,國內(nèi)外大量的研究表明�；撬峥梢砸种贫鄠�器官纖維化的病理過程。肝臟、肺、心臟等器官在發(fā)生纖維化時,最為重要的就是成纖維細胞的活化、增殖、膠原堆積等病理過程。我們通過建立椎板切除術(shù)的小鼠模型,局部和腹腔注射兩個途徑給予牛磺酸處理,發(fā)現(xiàn)�；撬峥梢燥@著抑制椎板切除術(shù)后硬膜外疤痕粘連,體外實驗證實�；撬嵋种瞥衫w維細胞活化、增殖以及膠原形成的作用是通過下調(diào)EGR1實現(xiàn)的。第一部分:MMC-C通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路誘導(dǎo)脊髓損傷減壓術(shù)后硬膜外瘢痕成纖維細胞凋亡目的:術(shù)后硬膜外瘢痕粘連會關(guān)系到脊髓損傷后減壓手術(shù)的成敗。有研究證實,術(shù)后局部應(yīng)用絲裂霉素C可以有效減輕瘢痕粘連。術(shù)后瘢痕粘連與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路誘導(dǎo)的細胞凋亡相關(guān),但具體機制不明。方法:實驗擬探討絲裂霉素C對人硬膜外瘢痕成纖維細胞增殖和凋亡的作用機制,用絲裂霉素C(1,5,10,20,40 μg/mL)干預(yù)培養(yǎng)的人硬膜外瘢痕成纖維細胞,處理 12,24,48 h。結(jié)果:絲裂霉素C劑量、時間依賴性地抑制人硬膜外vR痕成纖維細胞生長。絲裂霉素C可顯著提高細胞中促凋亡蛋白:Fas,DR4,DR5,cleaved caspase-8/9,Bax,Bim和cleaved-3表達,同時顯著降低細胞抑制凋亡蛋白:Bcl-2和Bcl-xL的表達,但caspase-8/9抑制劑(Z-IETD-FMK和Z-LETD-FMK)并不能完全抑制絲裂霉素C誘導(dǎo)的細胞凋亡。同時,絲裂霉素C可劑量依賴性增加細胞中GRP78、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白(CHOP)和caspase-4蛋白的表達,從而激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。實驗采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制因子Salubrinal(Sal)可顯著抑制絲裂霉素C處理后細胞活性,同時通過降低細胞內(nèi)CHOP的表達而抑制凋亡。結(jié)論:結(jié)果證實,絲裂霉素C可部分地通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路誘導(dǎo)硬膜外瘢痕成纖維細胞的凋亡。第二部分:FK506通過CHOP通路激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)成纖維細胞凋亡目的:增生性瘢痕(HS)源自于成纖維細胞凋亡減慢及其增殖加快。因此,成纖維細胞凋亡是發(fā)展HS新治療策略的關(guān)鍵任務(wù)所在。既往報告顯示,FK506能夠減輕體內(nèi)瘢痕的形成,且還能夠誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER應(yīng)激)。然而,FK506對ER介導(dǎo)的成纖維細胞凋亡的作用尚不明確。方法:本研究中使用的是大鼠皮膚成纖維細胞。利用細胞計數(shù)試劑盒Kit-8檢測細胞活性,并通過膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶雙染色法檢測細胞凋亡。然后利用小干擾RNA(siRNA)或慢病毒感染執(zhí)行基因沉默。最后利用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)測定細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達,并通過免疫共沉淀法探索蛋白質(zhì)之間的相互作用。結(jié)果:FK506能夠顯著減弱細胞活性,誘導(dǎo)成纖維細胞凋亡。有趣的是,FK506處理后還能激活ER應(yīng)激。我們的研究進一步證實,通過激活CHOP而引發(fā)的ER應(yīng)激能夠調(diào)節(jié)FK506-誘導(dǎo)性細胞凋亡,這一點已通過利用TUDCA或CHOP沉默表達實現(xiàn)的ER應(yīng)激后的細胞凋亡減慢得以證明。此外,免疫共沉淀結(jié)果表明,FK506處理誘導(dǎo)FKBP12.6從RyR2中解離,并從ER膜遷移至胞質(zhì)液,進而加速了 ER應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡。結(jié)論:FK506誘導(dǎo)的成纖維細胞凋亡可通過經(jīng)CHOP信號通路的ER應(yīng)激加以調(diào)節(jié)。第三部分:�；撬嵬ㄟ^下調(diào)EGR1減輕椎板切除術(shù)后硬膜外纖維化目的:硬膜外纖維化是一種常見的椎板切除術(shù)后并發(fā)癥,現(xiàn)已證明其與手術(shù)結(jié)果不佳密切相關(guān)。先前的研究表明,�；撬釋Ψ魏透卫w維化具有顯著的抑制作用。我們進行這項研究為了考查�；撬釋ψ蛋迩谐g(shù)后模型大鼠硬膜外纖維化的影響,以及探討其可能的分子機制。方法:對每只大鼠進行椎板切除術(shù),建立硬膜外纖維化模型。�；撬崽幚砗�,使用Masson三色染色和免疫組織化學(xué)染色來檢測硬膜外纖維化情況。使用細胞計數(shù)試劑盒測定細胞存活率。進行膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶雙染檢測成纖維細胞的凋亡。采用微陣列檢測mRNA的顯著性變化。通過qRT-PCR測量mRNA的表達水平。通過慢病毒感染的方法建立相關(guān)蛋白穩(wěn)定敲除和過表達的細胞系。通過蛋白質(zhì)印跡測定纖維化相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果:�；撬犸@著降低模型大鼠中椎板切除術(shù)誘導(dǎo)的硬膜外纖維化水平。然而,由于TGF-β及其受體的表達水平?jīng)]有發(fā)生變化,證明�；撬岬倪@種作用與TGF-β/Smad途徑無關(guān)。另外,�；撬釋毎蛲鰩缀鯖]有影響。令人感興趣的是,�；撬嵩谠隗w和離體實驗中均顯著地降低EGR1(早期生長反應(yīng)蛋白1,一種纖維化的促進因子)的表達水平。而且,EGR1的過度表達增強了成纖維細胞的活化,而敲除EGR1表現(xiàn)出相反的作用,這表明EGR1在�；撬釋GF-β誘導(dǎo)纖維化的抑制中發(fā)揮重要作用。結(jié)論:牛磺酸在在體實驗中降低硬膜外纖維化和在離體實驗中減少成纖維細胞的活化是由EGR1介導(dǎo)的。牛磺酸有望成為椎板切除術(shù)后硬膜外纖維化的潛在預(yù)防藥物。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R687.3

【參考文獻】

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1 張宇;周初松;蔣剛彪;高飛;傅棟;;殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯/絲裂霉素C釋藥系統(tǒng)預(yù)防椎板切除術(shù)后硬脊膜外瘢痕粘連的實驗研究[J];中國修復(fù)重建外科雜志;2008年10期

2 張宇;尹慶水;周初松;蔣剛彪;張余;;絲裂霉素C釋藥系統(tǒng)的體外釋放與體內(nèi)植入實驗研究[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2008年09期

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本文編號：1649122