本文選題：成纖維細(xì)胞　切入點(diǎn)：凋亡　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：椎板切除術(shù)是脊柱外科最為常用的手術(shù)方式之一,然而椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕粘連嚴(yán)重影響了手術(shù)減壓的效果,因此成為一直困擾著脊柱外科醫(yī)生卻沒(méi)有得到很好解決的難題。因此,如何有效預(yù)防或減少椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕粘連對(duì)于保證術(shù)后療效顯得尤為重要。既往研究已經(jīng)證實(shí),椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕的形成主要是由于局部成纖維細(xì)胞異常增殖、過(guò)度活化、膠原大量堆積等原因。因此,如何抑制成纖維細(xì)胞異常增殖和過(guò)度活化成為該領(lǐng)域研究的關(guān)鍵點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外在預(yù)防瘢痕粘連方面,主要進(jìn)展包括:局部應(yīng)用生物材料阻斷成纖維細(xì)胞的浸潤(rùn)和聚集;局部應(yīng)用抑制成纖維細(xì)胞的增殖的藥物;局部應(yīng)用促進(jìn)成纖維細(xì)胞的凋亡的抗腫瘤藥物(如絲裂霉素、他克莫司、雷帕霉素等);以流體或半流體樣物質(zhì)包裹手術(shù)區(qū)域的神經(jīng)根和硬膜以及免疫治療。我們分別研究了絲裂霉素C(MMC-C)和他克莫司(FK506)對(duì)硬膜外瘢痕粘連的作用。體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MMC-C和FK506均可有效抑制成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成、促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡,從而顯著地抑制了硬膜外瘢痕的形成。然而局部應(yīng)用MMC-C、FK506對(duì)周圍神經(jīng)組織的產(chǎn)生的毒性作用,嚴(yán)重限制了這些藥物的臨床應(yīng)用。因此我們急需尋找一種既可以有效抑制疤痕形成,又可以避免生物毒性作用的藥物。牛磺酸(2-氨基乙烷亞磺酸)是一種哺乳動(dòng)物體內(nèi)極為豐富的氨基酸。是功能飲料中一種常見(jiàn)的添加成分。�；撬岵粌H具有調(diào)節(jié)滲透壓、穩(wěn)定細(xì)胞膜、調(diào)節(jié)神經(jīng)傳導(dǎo)等生物學(xué)作用,還可以保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激誘導(dǎo)的過(guò)氧化。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外大量的研究表明�；撬峥梢砸种贫鄠�(gè)器官纖維化的病理過(guò)程。肝臟、肺、心臟等器官在發(fā)生纖維化時(shí),最為重要的就是成纖維細(xì)胞的活化、增殖、膠原堆積等病理過(guò)程。我們通過(guò)建立椎板切除術(shù)的小鼠模型,局部和腹腔注射兩個(gè)途徑給予牛磺酸處理,發(fā)現(xiàn)牛磺酸可以顯著抑制椎板切除術(shù)后硬膜外疤痕粘連,體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)牛磺酸抑制成纖維細(xì)胞活化、增殖以及膠原形成的作用是通過(guò)下調(diào)EGR1實(shí)現(xiàn)的。第一部分:MMC-C通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路誘導(dǎo)脊髓損傷減壓術(shù)后硬膜外瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡目的:術(shù)后硬膜外瘢痕粘連會(huì)關(guān)系到脊髓損傷后減壓手術(shù)的成敗。有研究證實(shí),術(shù)后局部應(yīng)用絲裂霉素C可以有效減輕瘢痕粘連。術(shù)后瘢痕粘連與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān),但具體機(jī)制不明。方法:實(shí)驗(yàn)擬探討絲裂霉素C對(duì)人硬膜外瘢痕成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的作用機(jī)制,用絲裂霉素C(1,5,10,20,40 μg/mL)干預(yù)培養(yǎng)的人硬膜外瘢痕成纖維細(xì)胞,處理 12,24,48 h。結(jié)果:絲裂霉素C劑量、時(shí)間依賴性地抑制人硬膜外vR痕成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。絲裂霉素C可顯著提高細(xì)胞中促凋亡蛋白:Fas,DR4,DR5,cleaved caspase-8/9,Bax,Bim和cleaved-3表達(dá),同時(shí)顯著降低細(xì)胞抑制凋亡蛋白:Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá),但caspase-8/9抑制劑(Z-IETD-FMK和Z-LETD-FMK)并不能完全抑制絲裂霉素C誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。同時(shí),絲裂霉素C可劑量依賴性增加細(xì)胞中GRP78、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白(CHOP)和caspase-4蛋白的表達(dá),從而激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制因子Salubrinal(Sal)可顯著抑制絲裂霉素C處理后細(xì)胞活性,同時(shí)通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)CHOP的表達(dá)而抑制凋亡。結(jié)論:結(jié)果證實(shí),絲裂霉素C可部分地通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路誘導(dǎo)硬膜外瘢痕成纖維細(xì)胞的凋亡。第二部分:FK506通過(guò)CHOP通路激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡目的:增生性瘢痕(HS)源自于成纖維細(xì)胞凋亡減慢及其增殖加快。因此,成纖維細(xì)胞凋亡是發(fā)展HS新治療策略的關(guān)鍵任務(wù)所在。既往報(bào)告顯示,FK506能夠減輕體內(nèi)瘢痕的形成,且還能夠誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER應(yīng)激)。然而,FK506對(duì)ER介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞凋亡的作用尚不明確。方法:本研究中使用的是大鼠皮膚成纖維細(xì)胞。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒Kit-8檢測(cè)細(xì)胞活性,并通過(guò)膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。然后利用小干擾RNA(siRNA)或慢病毒感染執(zhí)行基因沉默。最后利用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)測(cè)定細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),并通過(guò)免疫共沉淀法探索蛋白質(zhì)之間的相互作用。結(jié)果:FK506能夠顯著減弱細(xì)胞活性,誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡。有趣的是,FK506處理后還能激活ER應(yīng)激。我們的研究進(jìn)一步證實(shí),通過(guò)激活CHOP而引發(fā)的ER應(yīng)激能夠調(diào)節(jié)FK506-誘導(dǎo)性細(xì)胞凋亡,這一點(diǎn)已通過(guò)利用TUDCA或CHOP沉默表達(dá)實(shí)現(xiàn)的ER應(yīng)激后的細(xì)胞凋亡減慢得以證明。此外,免疫共沉淀結(jié)果表明,FK506處理誘導(dǎo)FKBP12.6從RyR2中解離,并從ER膜遷移至胞質(zhì)液,進(jìn)而加速了 ER應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。結(jié)論:FK506誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞凋亡可通過(guò)經(jīng)CHOP信號(hào)通路的ER應(yīng)激加以調(diào)節(jié)。第三部分:牛磺酸通過(guò)下調(diào)EGR1減輕椎板切除術(shù)后硬膜外纖維化目的:硬膜外纖維化是一種常見(jiàn)的椎板切除術(shù)后并發(fā)癥,現(xiàn)已證明其與手術(shù)結(jié)果不佳密切相關(guān)。先前的研究表明,牛磺酸對(duì)肺和肝纖維化具有顯著的抑制作用。我們進(jìn)行這項(xiàng)研究為了考查牛磺酸對(duì)椎板切除術(shù)后模型大鼠硬膜外纖維化的影響,以及探討其可能的分子機(jī)制。方法:對(duì)每只大鼠進(jìn)行椎板切除術(shù),建立硬膜外纖維化模型。�；撬崽幚砗�,使用Masson三色染色和免疫組織化學(xué)染色來(lái)檢測(cè)硬膜外纖維化情況。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒測(cè)定細(xì)胞存活率。進(jìn)行膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶雙染檢測(cè)成纖維細(xì)胞的凋亡。采用微陣列檢測(cè)mRNA的顯著性變化。通過(guò)qRT-PCR測(cè)量mRNA的表達(dá)水平。通過(guò)慢病毒感染的方法建立相關(guān)蛋白穩(wěn)定敲除和過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)定纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果:牛磺酸顯著降低模型大鼠中椎板切除術(shù)誘導(dǎo)的硬膜外纖維化水平。然而,由于TGF-β及其受體的表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生變化,證明牛磺酸的這種作用與TGF-β/Smad途徑無(wú)關(guān)。另外,牛磺酸對(duì)細(xì)胞凋亡幾乎沒(méi)有影響。令人感興趣的是,牛磺酸在在體和離體實(shí)驗(yàn)中均顯著地降低EGR1(早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白1,一種纖維化的促進(jìn)因子)的表達(dá)水平。而且,EGR1的過(guò)度表達(dá)增強(qiáng)了成纖維細(xì)胞的活化,而敲除EGR1表現(xiàn)出相反的作用,這表明EGR1在牛磺酸對(duì)TGF-β誘導(dǎo)纖維化的抑制中發(fā)揮重要作用。結(jié)論:牛磺酸在在體實(shí)驗(yàn)中降低硬膜外纖維化和在離體實(shí)驗(yàn)中減少成纖維細(xì)胞的活化是由EGR1介導(dǎo)的。牛磺酸有望成為椎板切除術(shù)后硬膜外纖維化的潛在預(yù)防藥物。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R687.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 張宇;周初松;蔣剛彪;高飛;傅棟;;殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯/絲裂霉素C釋藥系統(tǒng)預(yù)防椎板切除術(shù)后硬脊膜外瘢痕粘連的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)修復(fù)重建外科雜志;2008年10期

2 張宇;尹慶水;周初松;蔣剛彪;張余;;絲裂霉素C釋藥系統(tǒng)的體外釋放與體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)研究[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2008年09期

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本文編號(hào)：1649122