本文選題：肉堿　切入點：糖尿病神經(jīng)病變　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:左卡尼汀(L-carnitine,LC)可用于糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy,DPN)的臨床治療,但其作用是否與抑制高糖致雪旺細(xì)胞(Schwan cells,SC)的損傷有關(guān)有待研究,本研究通過建立高糖誘導(dǎo)的大鼠雪旺細(xì)胞系RSC96的損傷模型,擬探討左卡尼汀對高糖誘導(dǎo)下雪旺細(xì)胞損傷的影響及可能機(jī)制,為明確其治療DPN的機(jī)制提供新的理論參考。方法:將離體的大鼠雪旺細(xì)胞株(RSC96),以1.5×104/ml的密度接種于96孔板(200μl/孔)或以2×105/ml的密度接種于6孔板(2ml/孔)。1、將上述細(xì)胞分別于設(shè)定的葡萄糖終濃度為25mmol/L、50mmol/L、100mmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h,采用甲基四唑藍(lán)(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-diphenytetrazoliumromide,MTT)測RSC96的細(xì)胞活性,依據(jù)結(jié)果選擇合適的高糖濃度。然后分別在LC終濃度為10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、100μmol/L培養(yǎng)液中處理細(xì)胞,測定48 h后細(xì)胞活性,根據(jù)MTT結(jié)果選擇最佳左卡尼汀藥物濃度。為排除高糖引起的滲透壓對實驗結(jié)果的影響,設(shè)甘露醇組作為對照組。2、根據(jù)上一步實驗結(jié)果,本部分實驗選擇高糖刺激濃度為50mmol/L,左卡尼汀藥物終濃度為50μmol/L。將RSC96細(xì)胞隨機(jī)分為五組:正常對照組(C組)、高糖組(H組)、高糖+左卡尼汀組(H+L組)、單獨左卡尼汀組(L組)、甘露醇組(M組),培養(yǎng)48h后,觀察各組生長狀況并分別拍照;測定各組細(xì)胞凋亡率;測定各組細(xì)胞SOD的活力以及MDA的含量;采用Western Blot方法檢測各組細(xì)胞內(nèi)聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶-1(PARP(poly(ADP-ribose)polymerase-1),PARP-1)、門冬氨酸特異半胱氨酶3(Cysteine aspartate-specific protease-3,Caspase-3)的蛋白表達(dá)。結(jié)果:1、MTT結(jié)果顯示,高糖處理后細(xì)胞活性降低,并且損傷效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴性。使用濃度為50mmol/L高糖培養(yǎng)48h會導(dǎo)致細(xì)胞活性降為C組活性的58%(P0.05),引起細(xì)胞增殖活性顯著降低,因此選擇50mmol/L作為后續(xù)實驗的高糖劑量。左卡尼汀培養(yǎng)液對正常雪旺細(xì)胞增值活性無明顯影響(P0.05),但可以顯著改善高糖所致的雪旺細(xì)胞活性降低,結(jié)果顯示左卡尼汀濃度為50μmol/L時的細(xì)胞活性顯著高于其他劑量組,因此選擇50μmol/L的左卡尼汀作為后續(xù)實驗的藥物劑量。2、與C組相比,H組和H+L組貼壁細(xì)胞減少,懸浮細(xì)胞增多,SOD活性降低,MDA含量和細(xì)胞凋亡率升高,細(xì)胞內(nèi)活化的Caspase-3片段和PARP-1片段表達(dá)均明顯升高(P0.05);H組、M組上述指標(biāo)與C組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與H組比較,H+L組貼壁細(xì)胞增多,細(xì)胞連接增多,懸浮細(xì)胞減少,SOD活性升高,MDA含量和細(xì)胞凋亡降低率,細(xì)胞內(nèi)活化的Caspase-3和PARP-1片段表達(dá)均明顯降低(P0.05)。結(jié)論:高糖可誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞的損傷,且與高糖引起的高滲透壓無關(guān),與雪旺細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高而引起的細(xì)胞毒性有關(guān)。左卡尼汀對高糖致雪旺細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與降低氧化應(yīng)激水平,下調(diào)PARP-1(89kDa)、Caspase-3(17kDa)的表達(dá),減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。
[Abstract]:Objective: L-carnitine L-carnitine may be used in the treatment of diabetic peripheral neuropathy (peripheral), but whether the effect of L-carnitine can inhibit the injury of Schwan-Schwann cells (SCS) induced by high glucose needs to be studied. In this study, we established the model of RSC96 damage induced by high glucose in rat Schwann cell line, to explore the effect of L-carnitine on the damage induced by high glucose and its possible mechanism. Methods: the isolated rat Schwann cell line RSC96 was inoculated at a density of 1.5 脳 10 4 / ml to the 96-well plate (200 渭 l / well) or 2 脳 105 / ml to the 6-well plate (2ml / pore 路1). The cell activity of RSC96 was measured by methyl tetrazolium tetrazolium romidedetron (MTT) after 48 h culture on a culture medium with a final glucose concentration of 25 mmol / L 50 mmol / L or 100 mmol / L, and methyltetrazoliumromide MTT was used to measure the cell activity of RSC96 with methyl tetrazolium tetrazolium romidedet MTT (5-diphenytetrazolium romidede MTT). According to the results, the optimal concentration of high glucose was selected, and then the cells were treated with the final concentration of 10 渭 mol / L ~ (25 渭 mol / L ~ (-1)) 50 渭 mol / L ~ (50) 渭 mol / L ~ (75) 渭 mol 路L ~ (-1) / L ~ (100) 渭 mol/L, and the cell activity was measured after 48 h. In order to exclude the effect of osmotic pressure caused by high glucose on the experimental results, the mannitol group was used as the control group. In this part of the experiment, 50 mmol / L high glucose stimulation concentration and 50 渭 mol / L L-carnitine final drug concentration were selected. The RSC96 cells were randomly divided into five groups: normal control group (C group), high glucose group (group H), high glucose group (L-carnitine group), high glucose group (L-carnitine group) and single L-carnitine group (L-carnitine group). After 48 hours of culture, mannitol group and mannitol group were cultured for 48 hours. The growth status of each group was observed and photographed, the apoptosis rate of each group was measured, the activity of SOD and the content of MDA in each group were measured. Western Blot method was used to detect the protein expression of polyadenosine diphosphate-ribose polymerase-1 (PARP-1) and aspartate specific cysteine aspartate-specific protease-3 (Caspase-3) in the cells of each group. Results the cell activity was decreased after high glucose treatment, and the protein expression of PARP-1 and aspartate specific cysteine aspartate-specific protease-3caspase-3 were detected by Western Blot. The damage effect was in a dose-dependent manner. After 48 hours of high glucose concentration of 50 mmol / L, the cell activity decreased to 58% of group C activity, and the proliferation activity decreased significantly. Therefore, 50 mmol / L was chosen as the high glucose dose in the follow-up experiment. The L-carnitine medium had no significant effect on the proliferation activity of normal Schwann cells, but could significantly improve the decrease of Schwann cell activity induced by high glucose. The results showed that the cell activity of levocarnitine at 50 渭 mol/L was significantly higher than that of other dose groups. Therefore, when 50 渭 mol/L levocarnitine was selected as the drug dose of the follow-up experiment, the adherent cells in H and H L groups were decreased compared with those in C group. Superoxide dismutase (SOD) activity in suspension cells decreased MDA content and apoptosis rate. The expression of activated Caspase-3 fragments and PARP-1 fragments in HL-H group was significantly higher than that in group C, but the number of adherent cells and cell junctions in HL-treated group was higher than that in group C, but there was no significant difference between group C and group C in the expression of Caspase-3 fragments and PARP-1 fragments in HL-H group, and the number of adherent cells in HL group was higher than that in group C. The decrease of SOD activity in suspension cells increased the content of MDA and the rate of apoptosis, and the expression of activated Caspase-3 and PARP-1 fragments decreased significantly. Conclusion: high glucose can induce the damage of Schwann cells, and it is not related to the high osmotic pressure induced by high glucose. L-carnitine has protective effect on the injury of Schwann cells induced by high glucose. The mechanism may be related to the decrease of oxidative stress level and the down-regulation of the expression of PARP-1 and 89kDaCaspase-3Caspase-317kDa. It is related to reducing apoptosis.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R614

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本文編號：1634423