本文選題：骨髓間充質(zhì)干細胞　切入點：血紅素加氧酶-1　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的:通過建立大鼠50%減體積肝移植排斥模型,檢測載有血紅素加氧酶-1(HO-1)基因的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞(BMMSCs)形成的HO-1/MSCs對減體積肝移植排斥模型受體的保護作用,同時探討其可能機制。研究方法:(1)BMMSCs的體外培養(yǎng)及擴增采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選法,在倒置顯微鏡下觀察其形態(tài),流式細胞術(shù)鑒定其表型,染色法檢測其轉(zhuǎn)化為脂肪和成骨細胞的能力。將載有HO-1基因的重組腺病毒載體感染至BMMSCs,構(gòu)建HO-l/MSCs,熒光顯微鏡觀察其轉(zhuǎn)染率。(2)建立穩(wěn)定的大鼠原位、50%減體積、30%減體積肝移植排斥模型,觀察各組術(shù)后1、3、7和14d存活率,分析死亡原因。檢測外周血清中的ALT、AST及TBIL水平;光鏡觀察移植肝臟組織病理學(xué)改變和排斥反應(yīng)分級。(3)冰切片技術(shù)檢測HO-l/MSCs在肝臟內(nèi)分布情況;將50%減體積肝移植排斥模型分4組:①生理鹽水處理組(NS組);②HO-1組;③BMMSCs組;④HO-l/MSCs組。觀察受體術(shù)后臨床表現(xiàn)、存活時間,計算存活率率;測肝重,計算肝再生速率;免疫組化染色觀察增殖細胞核抗原(PCNA)表達水平,計算PCNA指數(shù);ELISA法測外周血清肝細胞生長因子(HGF)水平。(4)模型和分組同前,檢測外周血清中的ALT、AST及TBIL水平;光鏡觀察移植肝臟組織病理學(xué)改變和排斥反應(yīng)分級;透射電鏡下觀察移植肝臟組織的超微結(jié)構(gòu)改變;ELISA法檢測各組大鼠在各時間點外周血清IL-10、TGF-β、IL-2、IL-17、IL-23及TNF-α的水平;流式細胞術(shù)測定外周血清調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)水平。研究結(jié)果:(1)細胞貼壁生長成熟后,主要為長梭形,部分可以為漩渦或菊花狀排列,具備BMMSCs典型形態(tài)特征。流式細胞術(shù)鑒定細胞表面抗原結(jié)果顯示:CD29、CD90和RT1A陽性率分別為97.50%、93.30%和96.70%,CD34、CD45和RT1B陰性率均99%。染色法結(jié)果顯示:油紅O染色示胞漿內(nèi)出現(xiàn)紅色脂滴,Von Kossa染色示細胞中出現(xiàn)黑色鈣鹽。構(gòu)建HO-l/MSCs 48h后,細胞綠色熒光陽性表達率大約85%。(2)觀察受體鼠存活率及肝體積結(jié)果:原位組1、3、7和14d存活率分別為91.20%、86.50%、81.10%和75.70%;50%減體積組移植肝占全肝百分比為:(49.30士1.43)%,1、3、7和14d存活率分別為85.00%、80.00%、62.50%和45.50%;30%減體積組移植肝占全肝百分比為(31.20士1.74)%,1、3、7和14d存活率分別為65.00%、50.00%、35.00%和17.50%。30%減體積組1、3、7和14d存活率與原位組及50%減體積組分別相比,都降低,存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。外周肝功能(ALT、AST及TBIL)水平:30%減體積組分別與原位及50%減體積組相比較,都降低,存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。各組術(shù)后7d病理均顯示存在中到重度排斥反應(yīng)。(3)HO-l/MSCs在肝臟內(nèi)分布、受體大鼠存活率及肝再生情況:冰切片顯示HO-l/MSCs在移植肝臟內(nèi)分布密集。NS、HO-l、BMMSCs和HO-l/MSCs組受體大鼠的中位生存時間分別為13、15、25和38d;HO-l/MSCs組與其他三組相比,存活率提高,均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);BMMSCs組與NS、HO-l組相比,存活率提高,均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。HO-l/MSCs組與其他三組相比,術(shù)后3、5、7和14d肝再生速率、PCNA指數(shù)以及外周血清HGF水平均升高,存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);BMMSCs組與NS、HO-l組相比,同樣升高,存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(4)觀察HO-l/MSCs對50%減體積肝移植排斥模型的免疫調(diào)節(jié)作用:①本部分各組術(shù)后受體一般情況及存活率比較結(jié)果同第三部分。②肝功能的結(jié)果:各組ALT水平從術(shù)后即刻升高,3h達到最高峰后下降,3d降到最低,后又有所升高,5d后又降低;AST水平除在6h達到最高峰以外,其余均同ALT;各組TBIL水平從術(shù)后即刻開始緩慢升高,5d時急劇升高,直到14d;以上肝功指標,HO-l/MSCs組與其他三組分別比較,除0h外各個時間點均顯著降低,存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);BMMSCs組與NS、HO-l組分別比較,也是除0h外在各個時間點降低,存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。③病理結(jié)果顯示:NS、HO-l組病理表現(xiàn)基本相似,術(shù)后急性排斥反應(yīng)進行性加重,第7d呈現(xiàn)中到重度急性排斥反應(yīng),不同之處在于急性排斥程度稍輕。BMMSCs、HO-l/MSCs組病理表現(xiàn)基本相似:7d內(nèi)僅表現(xiàn)為輕度排斥反應(yīng),7d后排斥反應(yīng)急劇加重;不同之處在于BMMSCs組14d時與NS組相比排斥反應(yīng)稍輕,而HO-l/MSCs組則仍比NS組輕,差異明顯。按Banff標準進行排斥反應(yīng)程度分級,HO-l/MSCs組明顯低于其他三組,存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);BMMSCs組除14d外均低于NS、HO-l組,存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。④細胞因子檢測顯示:與其他三組相比較,HO-l/MSCs組中IL-10與TGF-β顯著升高,IL-2、IL-17、IL-23及TNF-α顯著降低,存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。⑤Treg檢測結(jié)果顯示:各組外周血清Treg水平比較,也有與肝臟病理和細胞因子相同的趨勢。研究結(jié)論:(1)體外采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁這一方法分離、純化以及擴增BMMSCs是簡單可行的,所獲細胞在形態(tài)學(xué)具有BMMSCs典型特點,表型鑒定結(jié)果也符合BMMSCs表型特點,同時其還能被誘導(dǎo)分化成為脂肪細胞和成骨細胞,這些就證明所獲細胞即為BMMSCs。在此基礎(chǔ)上,可以構(gòu)建形成穩(wěn)定的HO-1/MSCs,為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。(2)建立的減體積肝移植排斥模型穩(wěn)定,并選定50%減體積肝移植排斥模型作為后續(xù)實驗研究模型。(3)與單純BMMSCs相比,HO-1/MSCs能更好地發(fā)揮促進減體積肝移植術(shù)后移植肝再生的作用,并且通過影響HGF水平發(fā)揮促進肝再生作用。這就為HO-1/MSCs用于臨床促進肝再生方面提供了實驗基礎(chǔ)以及理論依據(jù)。(4)與單純BMMSCs相比,HO-1/MSCs能更好地發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,對減體積肝移植排斥模型的移植物有更好的保護作用,這就為HO-1/MSCs用于臨床抗肝移植術(shù)后免疫排斥方面提供了實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R657.3

【共引文獻】

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本文編號：1618503