本文選題：端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶　切入點(diǎn)：基因轉(zhuǎn)染　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:以逆轉(zhuǎn)錄病毒PLXSN為載體,將h TERT基因轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的大鼠雪旺細(xì)胞,檢測雪旺細(xì)胞端粒酶活性及細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。進(jìn)一步探討h TERT基因修飾雪旺細(xì)胞移植對脊髓損傷大鼠損傷區(qū)神經(jīng)修復(fù)相關(guān)相關(guān)白表達(dá)的檢測及對神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。方法:體外培養(yǎng)大鼠雪旺細(xì)胞,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒PLXSN為載體介導(dǎo)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(h TERT)基因轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞,體外培養(yǎng)Wistar大鼠雪旺細(xì)胞,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒PLXSN為載體介導(dǎo)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(h TERT)基因轉(zhuǎn)染,分為3組:對照組、陰性轉(zhuǎn)染組、h TERT轉(zhuǎn)染組。用RT-PCR,Western blot檢測雪旺細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前后h TERT基因和蛋白的表達(dá)。應(yīng)用細(xì)胞生長曲線、MTT比色法觀察細(xì)胞生長的優(yōu)化作用;采用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期分布的變化。成年雌性Wistar大鼠71只,造模成功66只,隨機(jī)分為對照組,SCs組,h TERT-SCs組,22只/組,按照改良的Allen打擊法建立大鼠急性脊髓損傷模型。分別于造模前、造模后1天、3天、1周、2周、3周、4周通過BBB評(píng)分、斜板試驗(yàn)、改良的Tarlov評(píng)分進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定。造模后72 h通過RT—PCR、Western blot檢測脊髓損傷區(qū)周圍AQP4/9、MMP9/2基因轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá),TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況。造模后4周,HE染色及熒光顯微鏡觀測PKH-26標(biāo)記的SCs存活及分布情況,通過免疫組化法檢測GFAP、Nogo及NF200的表達(dá)量,行HRP示蹤觀察神經(jīng)纖維再生情況,通過SEP和MEP觀察大鼠神經(jīng)電生理恢復(fù)情況。結(jié)果:通過逆轉(zhuǎn)錄病毒PLXSN介導(dǎo)的h TERT基因轉(zhuǎn)染大鼠雪旺細(xì)胞后,轉(zhuǎn)染h TERT后,h TERT轉(zhuǎn)染組與對照組、陰性轉(zhuǎn)染組相比h TERT基因和蛋白水平均有表達(dá),細(xì)胞的生長速度明顯增快,細(xì)胞周期G0/G1期減少,S期細(xì)胞數(shù)增多。各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。RT-PCR,Western blot檢測顯示轉(zhuǎn)染h TERT基因的大鼠雪旺細(xì)胞體外能表達(dá)h TERT;大鼠下肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)h TERT-SCs組優(yōu)于SCs組,SCs組優(yōu)于對照組。造模后72小時(shí)h TERT-SCs組細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯低于對照組(p0.05).造模后72小時(shí),與對照組相比h TERT-SCs組AQP4/9基因和蛋白表達(dá)均較顯著降低(p0.05)。造模后4周,HE染色對照組可見脊髓組織缺失及脊髓空洞形成,無神經(jīng)軸索通過。SCs組損傷區(qū)可見少量神經(jīng)軸索樣結(jié)構(gòu),脊髓空洞較小,h TERT-SCs組可見較多神經(jīng)軸索樣結(jié)構(gòu),未見脊髓空洞。PKH-26標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù):h TERT-SCs組最多,SCs組次之,對照組最少,且各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。造模后4周,h TERT-SCs組膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)、神經(jīng)絲蛋白(NF-200)的表達(dá)較對照組明顯升高,差異有顯著性意義(p0.05),h TERT-SCs組Nogo蛋白的表達(dá)較對照組明顯降低,差異有顯著性意義(p0.05),HRP陽性神經(jīng)纖維數(shù):h TERT-SCs組最多,SCs組次之,對照組最少,各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。SEP和MEP的潛伏期:h TERT-SCs組SCs組對照組,且各組之間差異有顯著性意義(p0.05);波幅:h TERT-SCs組SCs組對照組,且各組之間差異有顯著性意義(p0.05)。結(jié)論:通過轉(zhuǎn)錄病毒PLXSN為載體介導(dǎo)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(h TERT)基因轉(zhuǎn)染使雪旺細(xì)胞端粒酶活性明顯升高,能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠雪旺細(xì)胞增殖。h TERT基因修飾雪旺細(xì)胞移植可促進(jìn)脊髓損傷大鼠神經(jīng)突觸的再生,降低脊髓損傷區(qū)周圍AQP/9、MMP9/2基因轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡,促進(jìn)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)、神經(jīng)絲蛋白(NF-200)的表達(dá)的升高,降低Nogo蛋白的表達(dá),改善大鼠的肢體運(yùn)動(dòng)功能和電生理功能。
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【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R651.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 王求永;劉文革;王振宇;;FTY720對大鼠急性脊髓損傷后RhoA表達(dá)的影響[J];中國骨科臨床與基礎(chǔ)研究雜志;2010年04期

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本文編號(hào)：1582400