本文選題：TLR4　切入點：調控　出處：《南京醫(yī)科大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)中的天然免疫細胞,參與監(jiān)測CNS的內環(huán)境變化,在接受大腦損傷信號后發(fā)生活化,具體表現(xiàn)為小膠質細胞改變細胞形態(tài),遷移到受損的部位,出現(xiàn)不同程度的增生,合成并分泌多種免疫調節(jié)因子;也可以轉變成具有高度吞噬作用的細胞,清除死細胞、蛋白沉積以及病原體等等。與其它膠質細胞不同,小膠質細胞與其他組織中的巨噬細胞來源于同一個細胞系,招募血液中的單核細胞進入中樞可以進一步影響中樞定居的小膠質細胞的活化,放大中樞神經炎癥。大量研究表明,小膠質細胞活化能夠影響神經元的功能,與術后認知功能障礙(Postoperative cognitive dysfunction,POCD)以及阿爾茨海默等多種神經退行性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。POCD是指患者手術后出現(xiàn)的CNS的嚴重并發(fā)癥,老年以及嚴重的手術創(chuàng)傷是POCD的兩大主要危險因素。盡管目前POCD的確切病理機制仍不明確,但是大量的研究表明中樞神經炎癥在POCD的發(fā)生發(fā)展中至關重要。近年來,本研究小組發(fā)現(xiàn)氯化鋰(Lithium chloride,Li Cl)作為一種GSK-3β抑制劑和神經保護藥物,可以減輕老年大鼠腹部探查術后的學習記憶能力下降。大量研究證明TLR4信號通路的活化可以導致大量的炎癥介質的合成和釋放,在體和離體的前期研究均發(fā)現(xiàn)Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)與中樞神經炎癥以及神經退行性疾病甚至POCD的發(fā)生發(fā)展密切相關。作為重要的炎性細胞因子,S100鈣結合蛋白A8(S-100 calcium binding protein A8,S100 A8)能夠趨化中性粒細胞等進入炎癥部位,參與多種炎癥反應。近年來,多項研究表明S100A8作為TLR4的內源性配體,可以活化TLR4信號通路參與中樞神經炎癥。然而,S100A8是否與TLR4/My D88(Myeloid differentiation factor 88,髓樣分化因子88)通路存在相互作用,進而參與調控POCD相關的中樞炎癥,仍需要進一步的研究。本研究工作的第一部分首先初步探討了TLR4信號通路在Li Cl改善小膠質細胞活化中的調節(jié)作用,然后進一步觀察了Li Cl對老年大鼠脾臟切除手術后認知功能下降的保護作用及其對TLR4信號通路以及小膠質細胞增生的影響;第二部分首先探討了在小鼠脛骨骨折手術的模型中,TLR4信號通路的活化對海馬小膠質細胞增生的調控在POCD發(fā)生發(fā)展中的作用(第一節(jié));其次,在該模型中進一步研究S100A8對POCD的調節(jié)作用,以及S100A8與TLR4信號通路的相互作用對中樞神經炎癥甚至POCD的影響(第二節(jié))。第一部分氯化鋰預處理可能通過抑制小膠質細胞表面TLR4的活化改善老年大鼠脾臟切除手術后認知功能的下降目的:探討小膠質細胞表面的TLR4信號通路在Li Cl改善POCD中的作用。方法:⑴離體實驗部分:首先使用1μg/ml的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激BV-2小膠質細胞,在體外模仿中樞神經炎癥;進一步在LPS刺激小膠質細胞前預先給予細胞10 m M的Li Cl和/或者100 n M的TLR4小干擾RNA(Small interfering RNA,si RNA),PCR法檢測LPS刺激4小時后所有的細胞中腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)和TLR4表達。⑵在體實驗部分:將老年大鼠隨機分為4組:生理鹽水組、腹腔注射Li Cl組、腹腔注射生理鹽水后行脾臟切除手術組、腹腔注射Li Cl后行脾臟切除手術組,手術后24小時,采用Morris水迷宮和開場實驗檢測大鼠認知功能的改變;采用Elisa法檢測大鼠血清和腦脊液中TNF-α和白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)表達的變化;采用PCR法檢測大鼠海馬中TNF-α和IL-1β表達的變化;采用Western blot以及PCR法檢測海馬TLR4信號通路的變化;采用免疫組化標記CD11b檢測大鼠海馬小膠質細胞的數(shù)目。結果:小膠質細胞接受LPS刺激后TNF-α和TLR4的m RNA表達顯著增加,Li Cl或者TLR4 si RNA預處理可以同時抑制LPS誘導的TNF-α和TLR4表達,聯(lián)合使用Li Cl和TLR4 si RNA兩種預處理后,再接受LPS刺激的小膠質細胞中TNF-α和TLR4的m RNA表達甚至可以降低到基礎水平。在體實驗部分,老年大鼠脾臟切除手術后認知功能下降,手術前連續(xù)7天預先給予老年大鼠2 m M/kg的Li Cl,不僅可以改善大鼠術后認知功能的下降,還可以抑制手術導致的血清、腦脊液以及海馬中TNF-α和IL-1β的表達,降低術后海馬CA1區(qū)CD11b+區(qū)域的面積。老年大鼠脾臟切除手術后海馬中的TLR(1-9)中僅有TLR2和TLR4m RNA的表達顯著增加,而Li Cl的預處理可抑制術后大鼠海馬中TLR4/NF-κB(Nuclear factorκB,核因子κB)的活化。結論:TLR4信號通路參與Li Cl對神經炎癥的改善;Li Cl可以抑制TLR4信號通路活化,改善LPS誘導的小膠質細胞活化以及術后外周和中樞的炎癥,最終抑制POCD的發(fā)生發(fā)展。第二部分S100A8調控小鼠脛骨骨折手術后的認知功能障礙依賴于TLR4/My D88信號通路的活化第一節(jié)探討TLR4對中樞小膠質細胞的調控在脛骨骨折手術導致的小鼠認知功能下降中的作用目的:研究、闡明TLR4信號通路的活化對海馬小膠質細胞增生的調控在POCD發(fā)生發(fā)展中的作用。方法:⑴按照C57BL/6野生型小鼠是否接受脛骨骨折手術以及手術后觀察的時間點不同共分為5組:對照組和4個手術組(手術后6、12、24和48小時組),采用Y迷宮和開場實驗檢測手術后24小時小鼠認知功能的改變;采用PCR和Western blot分別檢測小鼠手術后外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)以及脾臟和海馬中TLR4/My D88信號通路的表達。⑵進一步對TLR4-/-小鼠、My D88-/-小鼠以及各自對應的背景小鼠進行脛骨骨折手術,同樣分為5組,免疫熒光標記Iba-1檢測手術后海馬小膠質細胞的活化情況;流式細胞分析檢測其中TLR4-/-小鼠以及背景小鼠手術后24小時中樞中來源于外周的骨髓源性巨噬細胞的數(shù)目變化,并采用Y迷宮和開場實驗檢測它們認知功能的改變。結果:C57BL/6野生型小鼠術后24小時出現(xiàn)焦慮以及學習記憶能力的下降,小鼠的PBMCs、脾臟以及海馬中的TLR4/My D88分別從手術后6小時和12小時發(fā)生活化。從手術后12小時開始,野生型小鼠海馬CA3區(qū)小膠質細胞明顯增生活化,然而與各自對應的野生型小鼠相比,TLR4-/-以及My D88-/-小鼠手術后海馬CA3區(qū)小膠質細胞增生持續(xù)的時間縮短,Iba-1免疫陽性區(qū)域的面積減少。野生型小鼠手術后24小時,大腦中CD45hiCD11b+的細胞數(shù)目顯著增多,然而,TLR4-/-小鼠手術后這種類型的細胞數(shù)目沒有出現(xiàn)明顯的變化,而且這種小鼠術后24小時在Y迷宮和開場實驗中的表現(xiàn)也沒有出現(xiàn)與野生型小鼠類似的下降。結論:TLR4信號通路的活化可以促進骨髓源性巨噬細胞進入中樞,促進中樞小膠質細胞的活化,參與調控POCD的發(fā)生發(fā)展。第二節(jié)探討S100A8和TLR4之間的相互作用對中樞神經炎癥以及POCD的調控目的:研究S100 A8對POCD的調節(jié)作用,以及S100A8與TLR4信號通路的相互作用對中樞神經炎癥甚至POCD的影響。方法:⑴按照C57BL/6野生型小鼠是否接受脛骨骨折手術以及手術后觀察的時間點不同共分為5組:對照組和4個手術組(手術后6、12、24和48小時組),采用PCR和Western blot分別檢測小鼠手術后PBMCs、脾臟和海馬中S100A8和S100A9的表達。⑵在C57BL/6野生型小鼠進行脛骨骨折手術前60分鐘,分別對小鼠腹腔注射100μg S100A8的抗體或者等體積的生理鹽水,采用Y迷宮和開場實驗檢測手術后24小時小鼠認知功能的改變;免疫熒光標記Iba-1檢測海馬小膠質細胞的增生活化情況。⑶分別對TLR4-/-小鼠以及野生型小鼠腹腔或者側腦室注射S100A8蛋白,采用流式細胞分析檢測所有的小鼠PBMCs和海馬小膠質細胞中的TLR4活化;免疫熒光標記Iba-1檢測手術后海馬小膠質細胞的活化情況。⑷對TLR4-/-小鼠、My D88-/-小鼠以及各自對應的背景小鼠進行脛骨骨折手術,同樣分別分為上述5組,采用Western blot檢測小鼠手術后脾臟和海馬中S100A8和S100A9的表達。結果:在手術后6小時至24小時,甚至48小時內,野生型小鼠的PBMCs、脾臟中的S100A8和S100A9表達顯著升高;從手術后12開始到術后48小時,野生型小鼠海馬中S100A8和S100A9表達顯著升高。S100A8的抗體可以明顯抑制野生型小鼠手術后24小時海馬中的小膠質細胞增生,改善小鼠術后認知功能。野生型小鼠手術后脾臟中表達的S100A8的同時呈現(xiàn)TLR4陽性。腹腔或者側腦室注射的S100A8蛋白可以活化野生型小鼠PBMCs和海馬中的CD11b+細胞表面的TLR4,促進海馬小膠質細胞的增生。然而與野生型小鼠相比,腹腔注射S100A8蛋白的TLR4-/-小鼠,海馬中小膠質細胞的增生明顯減少,而側腦室注射S100A8蛋白的TLR4-/-小鼠,海馬中沒有出現(xiàn)顯著的小膠質細胞增生。另外,與對應的手術后野生型小鼠相比,TLR4-/-以及My D88-/-小鼠手術后外周和中樞中的S100A8和S100A9的表達顯著減少。結論:S100A8促進中樞小膠質細胞的活化,參與調控POCD的發(fā)生發(fā)展。S100A8和TLR4之間相互調控促進中樞炎癥以及POCD的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R614

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本文編號：1571333