本文選題：TLR4　切入點(diǎn)：調(diào)控　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)中的天然免疫細(xì)胞,參與監(jiān)測(cè)CNS的內(nèi)環(huán)境變化,在接受大腦損傷信號(hào)后發(fā)生活化,具體表現(xiàn)為小膠質(zhì)細(xì)胞改變細(xì)胞形態(tài),遷移到受損的部位,出現(xiàn)不同程度的增生,合成并分泌多種免疫調(diào)節(jié)因子;也可以轉(zhuǎn)變成具有高度吞噬作用的細(xì)胞,清除死細(xì)胞、蛋白沉積以及病原體等等。與其它膠質(zhì)細(xì)胞不同,小膠質(zhì)細(xì)胞與其他組織中的巨噬細(xì)胞來源于同一個(gè)細(xì)胞系,招募血液中的單核細(xì)胞進(jìn)入中樞可以進(jìn)一步影響中樞定居的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,放大中樞神經(jīng)炎癥。大量研究表明,小膠質(zhì)細(xì)胞活化能夠影響神經(jīng)元的功能,與術(shù)后認(rèn)知功能障礙(Postoperative cognitive dysfunction,POCD)以及阿爾茨海默等多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。POCD是指患者手術(shù)后出現(xiàn)的CNS的嚴(yán)重并發(fā)癥,老年以及嚴(yán)重的手術(shù)創(chuàng)傷是POCD的兩大主要危險(xiǎn)因素。盡管目前POCD的確切病理機(jī)制仍不明確,但是大量的研究表明中樞神經(jīng)炎癥在POCD的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要。近年來,本研究小組發(fā)現(xiàn)氯化鋰(Lithium chloride,Li Cl)作為一種GSK-3β抑制劑和神經(jīng)保護(hù)藥物,可以減輕老年大鼠腹部探查術(shù)后的學(xué)習(xí)記憶能力下降。大量研究證明TLR4信號(hào)通路的活化可以導(dǎo)致大量的炎癥介質(zhì)的合成和釋放,在體和離體的前期研究均發(fā)現(xiàn)Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)與中樞神經(jīng)炎癥以及神經(jīng)退行性疾病甚至POCD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。作為重要的炎性細(xì)胞因子,S100鈣結(jié)合蛋白A8(S-100 calcium binding protein A8,S100 A8)能夠趨化中性粒細(xì)胞等進(jìn)入炎癥部位,參與多種炎癥反應(yīng)。近年來,多項(xiàng)研究表明S100A8作為TLR4的內(nèi)源性配體,可以活化TLR4信號(hào)通路參與中樞神經(jīng)炎癥。然而,S100A8是否與TLR4/My D88(Myeloid differentiation factor 88,髓樣分化因子88)通路存在相互作用,進(jìn)而參與調(diào)控POCD相關(guān)的中樞炎癥,仍需要進(jìn)一步的研究。本研究工作的第一部分首先初步探討了TLR4信號(hào)通路在Li Cl改善小膠質(zhì)細(xì)胞活化中的調(diào)節(jié)作用,然后進(jìn)一步觀察了Li Cl對(duì)老年大鼠脾臟切除手術(shù)后認(rèn)知功能下降的保護(hù)作用及其對(duì)TLR4信號(hào)通路以及小膠質(zhì)細(xì)胞增生的影響;第二部分首先探討了在小鼠脛骨骨折手術(shù)的模型中,TLR4信號(hào)通路的活化對(duì)海馬小膠質(zhì)細(xì)胞增生的調(diào)控在POCD發(fā)生發(fā)展中的作用(第一節(jié));其次,在該模型中進(jìn)一步研究S100A8對(duì)POCD的調(diào)節(jié)作用,以及S100A8與TLR4信號(hào)通路的相互作用對(duì)中樞神經(jīng)炎癥甚至POCD的影響(第二節(jié))。第一部分氯化鋰預(yù)處理可能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞表面TLR4的活化改善老年大鼠脾臟切除手術(shù)后認(rèn)知功能的下降目的:探討小膠質(zhì)細(xì)胞表面的TLR4信號(hào)通路在Li Cl改善POCD中的作用。方法:⑴離體實(shí)驗(yàn)部分:首先使用1μg/ml的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞,在體外模仿中樞神經(jīng)炎癥;進(jìn)一步在LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞前預(yù)先給予細(xì)胞10 m M的Li Cl和/或者100 n M的TLR4小干擾RNA(Small interfering RNA,si RNA),PCR法檢測(cè)LPS刺激4小時(shí)后所有的細(xì)胞中腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)和TLR4表達(dá)。⑵在體實(shí)驗(yàn)部分:將老年大鼠隨機(jī)分為4組:生理鹽水組、腹腔注射Li Cl組、腹腔注射生理鹽水后行脾臟切除手術(shù)組、腹腔注射Li Cl后行脾臟切除手術(shù)組,手術(shù)后24小時(shí),采用Morris水迷宮和開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠認(rèn)知功能的改變;采用Elisa法檢測(cè)大鼠血清和腦脊液中TNF-α和白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)表達(dá)的變化;采用PCR法檢測(cè)大鼠海馬中TNF-α和IL-1β表達(dá)的變化;采用Western blot以及PCR法檢測(cè)海馬TLR4信號(hào)通路的變化;采用免疫組化標(biāo)記CD11b檢測(cè)大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果:小膠質(zhì)細(xì)胞接受LPS刺激后TNF-α和TLR4的m RNA表達(dá)顯著增加,Li Cl或者TLR4 si RNA預(yù)處理可以同時(shí)抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α和TLR4表達(dá),聯(lián)合使用Li Cl和TLR4 si RNA兩種預(yù)處理后,再接受LPS刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α和TLR4的m RNA表達(dá)甚至可以降低到基礎(chǔ)水平。在體實(shí)驗(yàn)部分,老年大鼠脾臟切除手術(shù)后認(rèn)知功能下降,手術(shù)前連續(xù)7天預(yù)先給予老年大鼠2 m M/kg的Li Cl,不僅可以改善大鼠術(shù)后認(rèn)知功能的下降,還可以抑制手術(shù)導(dǎo)致的血清、腦脊液以及海馬中TNF-α和IL-1β的表達(dá),降低術(shù)后海馬CA1區(qū)CD11b+區(qū)域的面積。老年大鼠脾臟切除手術(shù)后海馬中的TLR(1-9)中僅有TLR2和TLR4m RNA的表達(dá)顯著增加,而Li Cl的預(yù)處理可抑制術(shù)后大鼠海馬中TLR4/NF-κB(Nuclear factorκB,核因子κB)的活化。結(jié)論:TLR4信號(hào)通路參與Li Cl對(duì)神經(jīng)炎癥的改善;Li Cl可以抑制TLR4信號(hào)通路活化,改善LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化以及術(shù)后外周和中樞的炎癥,最終抑制POCD的發(fā)生發(fā)展。第二部分S100A8調(diào)控小鼠脛骨骨折手術(shù)后的認(rèn)知功能障礙依賴于TLR4/My D88信號(hào)通路的活化第一節(jié)探討TLR4對(duì)中樞小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)控在脛骨骨折手術(shù)導(dǎo)致的小鼠認(rèn)知功能下降中的作用目的:研究、闡明TLR4信號(hào)通路的活化對(duì)海馬小膠質(zhì)細(xì)胞增生的調(diào)控在POCD發(fā)生發(fā)展中的作用。方法:⑴按照C57BL/6野生型小鼠是否接受脛骨骨折手術(shù)以及手術(shù)后觀察的時(shí)間點(diǎn)不同共分為5組:對(duì)照組和4個(gè)手術(shù)組(手術(shù)后6、12、24和48小時(shí)組),采用Y迷宮和開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)手術(shù)后24小時(shí)小鼠認(rèn)知功能的改變;采用PCR和Western blot分別檢測(cè)小鼠手術(shù)后外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)以及脾臟和海馬中TLR4/My D88信號(hào)通路的表達(dá)。⑵進(jìn)一步對(duì)TLR4-/-小鼠、My D88-/-小鼠以及各自對(duì)應(yīng)的背景小鼠進(jìn)行脛骨骨折手術(shù),同樣分為5組,免疫熒光標(biāo)記Iba-1檢測(cè)手術(shù)后海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況;流式細(xì)胞分析檢測(cè)其中TLR4-/-小鼠以及背景小鼠手術(shù)后24小時(shí)中樞中來源于外周的骨髓源性巨噬細(xì)胞的數(shù)目變化,并采用Y迷宮和開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)它們認(rèn)知功能的改變。結(jié)果:C57BL/6野生型小鼠術(shù)后24小時(shí)出現(xiàn)焦慮以及學(xué)習(xí)記憶能力的下降,小鼠的PBMCs、脾臟以及海馬中的TLR4/My D88分別從手術(shù)后6小時(shí)和12小時(shí)發(fā)生活化。從手術(shù)后12小時(shí)開始,野生型小鼠海馬CA3區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生活化,然而與各自對(duì)應(yīng)的野生型小鼠相比,TLR4-/-以及My D88-/-小鼠手術(shù)后海馬CA3區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞增生持續(xù)的時(shí)間縮短,Iba-1免疫陽(yáng)性區(qū)域的面積減少。野生型小鼠手術(shù)后24小時(shí),大腦中CD45hiCD11b+的細(xì)胞數(shù)目顯著增多,然而,TLR4-/-小鼠手術(shù)后這種類型的細(xì)胞數(shù)目沒有出現(xiàn)明顯的變化,而且這種小鼠術(shù)后24小時(shí)在Y迷宮和開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)也沒有出現(xiàn)與野生型小鼠類似的下降。結(jié)論:TLR4信號(hào)通路的活化可以促進(jìn)骨髓源性巨噬細(xì)胞進(jìn)入中樞,促進(jìn)中樞小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,參與調(diào)控POCD的發(fā)生發(fā)展。第二節(jié)探討S100A8和TLR4之間的相互作用對(duì)中樞神經(jīng)炎癥以及POCD的調(diào)控目的:研究S100 A8對(duì)POCD的調(diào)節(jié)作用,以及S100A8與TLR4信號(hào)通路的相互作用對(duì)中樞神經(jīng)炎癥甚至POCD的影響。方法:⑴按照C57BL/6野生型小鼠是否接受脛骨骨折手術(shù)以及手術(shù)后觀察的時(shí)間點(diǎn)不同共分為5組:對(duì)照組和4個(gè)手術(shù)組(手術(shù)后6、12、24和48小時(shí)組),采用PCR和Western blot分別檢測(cè)小鼠手術(shù)后PBMCs、脾臟和海馬中S100A8和S100A9的表達(dá)。⑵在C57BL/6野生型小鼠進(jìn)行脛骨骨折手術(shù)前60分鐘,分別對(duì)小鼠腹腔注射100μg S100A8的抗體或者等體積的生理鹽水,采用Y迷宮和開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)手術(shù)后24小時(shí)小鼠認(rèn)知功能的改變;免疫熒光標(biāo)記Iba-1檢測(cè)海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的增生活化情況。⑶分別對(duì)TLR4-/-小鼠以及野生型小鼠腹腔或者側(cè)腦室注射S100A8蛋白,采用流式細(xì)胞分析檢測(cè)所有的小鼠PBMCs和海馬小膠質(zhì)細(xì)胞中的TLR4活化;免疫熒光標(biāo)記Iba-1檢測(cè)手術(shù)后海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況。⑷對(duì)TLR4-/-小鼠、My D88-/-小鼠以及各自對(duì)應(yīng)的背景小鼠進(jìn)行脛骨骨折手術(shù),同樣分別分為上述5組,采用Western blot檢測(cè)小鼠手術(shù)后脾臟和海馬中S100A8和S100A9的表達(dá)。結(jié)果:在手術(shù)后6小時(shí)至24小時(shí),甚至48小時(shí)內(nèi),野生型小鼠的PBMCs、脾臟中的S100A8和S100A9表達(dá)顯著升高;從手術(shù)后12開始到術(shù)后48小時(shí),野生型小鼠海馬中S100A8和S100A9表達(dá)顯著升高。S100A8的抗體可以明顯抑制野生型小鼠手術(shù)后24小時(shí)海馬中的小膠質(zhì)細(xì)胞增生,改善小鼠術(shù)后認(rèn)知功能。野生型小鼠手術(shù)后脾臟中表達(dá)的S100A8的同時(shí)呈現(xiàn)TLR4陽(yáng)性。腹腔或者側(cè)腦室注射的S100A8蛋白可以活化野生型小鼠PBMCs和海馬中的CD11b+細(xì)胞表面的TLR4,促進(jìn)海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的增生。然而與野生型小鼠相比,腹腔注射S100A8蛋白的TLR4-/-小鼠,海馬中小膠質(zhì)細(xì)胞的增生明顯減少,而側(cè)腦室注射S100A8蛋白的TLR4-/-小鼠,海馬中沒有出現(xiàn)顯著的小膠質(zhì)細(xì)胞增生。另外,與對(duì)應(yīng)的手術(shù)后野生型小鼠相比,TLR4-/-以及My D88-/-小鼠手術(shù)后外周和中樞中的S100A8和S100A9的表達(dá)顯著減少。結(jié)論:S100A8促進(jìn)中樞小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,參與調(diào)控POCD的發(fā)生發(fā)展。S100A8和TLR4之間相互調(diào)控促進(jìn)中樞炎癥以及POCD的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R614

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