本文關(guān)鍵詞： 神經(jīng)干細(xì)胞 NT-3 Sox2 TrkC 分化 PI3K/Akt信號(hào)通路　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)的發(fā)病率逐年增高,并且危害性大、神經(jīng)功能恢復(fù)差,已然成為當(dāng)前重要的醫(yī)學(xué)難題及社會(huì)公共問題。目前,神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)移植已發(fā)展成為人們探索治療脊髓損傷的新途徑。然而單純應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)SCI的修復(fù)作用并不理想,主要原因在于神經(jīng)干細(xì)胞難以向功能性神經(jīng)元分化而多分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(neurotrophin-3,NT-3)作為一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,與其特異性酪氨酸激酶受體C(tyrosine kinase receptor C,TrkC)結(jié)合后通過激活相關(guān)信號(hào)蛋白分子能夠?qū)ι窠?jīng)細(xì)胞的存活、增殖及分化起到重要的調(diào)控作用。另外,轉(zhuǎn)錄因子Sox2[SRY(sex determining region Y)-box 2],不僅具有干性維持作用,其在神經(jīng)細(xì)胞分化中的作用也受到越來越多的關(guān)注。本研究通過系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)外源性的NT-3能夠上調(diào)神經(jīng)干細(xì)胞中Sox2的表達(dá),后者進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向的分化,此過程是通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。其中,上調(diào)后的Sox2可能通過調(diào)控TrkC基因的轉(zhuǎn)錄而調(diào)節(jié)其蛋白的表達(dá),進(jìn)而影響神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向的分化。材料與方法1.原代大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定神經(jīng)干細(xì)胞來源于孕14~15天(d)Sprague-Dawley(SD)胎鼠的大腦皮層組織,參照Pluchino法進(jìn)行原代培養(yǎng)。首先,為了檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物巢蛋白(Nestin)及干性轉(zhuǎn)錄因子Sox2的表達(dá),將神經(jīng)干細(xì)胞球接種于預(yù)先使用多聚鳥氨酸(Poly-L-ornithine,P-L-O)包被過的激光共聚焦培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)24小時(shí)(h)后進(jìn)行Nestin及Sox2的免疫熒光(immunofluorescence,IF)染色鑒定。另外,為進(jìn)一步證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞具有多向分化潛能,將使用分化培養(yǎng)基[用1%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)代替生長(zhǎng)因子]培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物(Doublecortin,DCX)、少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物2(oligodendrocytes marker2,Olig2)及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的IF染色鑒定。2.NT-3對(duì)NSCs中Sox2蛋白表達(dá)量的影響為了檢測(cè)外源性的NT-3對(duì)NSCs中Sox2蛋白表達(dá)量的影響,我們將原代培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞隨機(jī)分為:對(duì)照組、25ng/mlnt-3組、50ng/mlnt-3組、100ng/mlnt-3組,各組細(xì)胞經(jīng)不同干預(yù)因素處理24h后,采用westernblot法檢測(cè)各組細(xì)胞中sox2蛋白表達(dá)水平的變化。3.nt-3對(duì)nscs分化的影響采用步驟2相同的分組方法,我們進(jìn)一步觀察了外源性nt-3對(duì)nscs分化的影響,各組細(xì)胞經(jīng)干預(yù)處理24h后,采用westernblot法及if染色法檢測(cè)不同濃度nt-3對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞向三系細(xì)胞分化的影響。4.pi3k/akt信號(hào)通路在nt-3調(diào)控sox2蛋白表達(dá)中的作用為了進(jìn)一步探討pi3k/akt信號(hào)通路在nt-3調(diào)控sox2蛋白表達(dá)中的重要作用,我們將原代培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞隨機(jī)分為:對(duì)照組、10umpi3k/akt通路阻斷劑(ly294002)組、100ng/mlnt-3組及l(fā)y294002(10um)+nt-3(100ng/ml)組,各組細(xì)胞經(jīng)處理24h后,采用westernblot法檢測(cè)各組p-akt、akt、sox2及dcx蛋白表達(dá)水平。并觀察了特異性的pi3k/akt通路阻斷劑ly294002能否阻斷nt-3上調(diào)sox2表達(dá)的作用。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有定量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用單因素方差分析(anova)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,p值小于0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.成功分離培養(yǎng)了具有多向分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞;首先,利用倒置相差顯微鏡從形態(tài)學(xué)上進(jìn)行觀察:原代培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞第3d時(shí),可見大量的神經(jīng)干細(xì)胞球呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。其次,從神經(jīng)干細(xì)胞分化性能上進(jìn)行鑒定,免疫熒光染色結(jié)果顯示:絕大多數(shù)原代培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)nestin及干性標(biāo)志物sox2;在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d后的nscs可分化為表達(dá)神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物dcx、少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物olig2及星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物gfap的三系細(xì)胞。2.nt-3上調(diào)了nscs中sox2的表達(dá);westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示:外源性的nt-3可明顯上調(diào)nscs中sox2的表達(dá),并呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。與對(duì)照組相比,較高濃度nt-3(25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)處理后的nscs中sox2蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。3.上調(diào)后的sox2進(jìn)一步促進(jìn)了nscs向神經(jīng)元的分化;首先,較高濃度的nt-3顯著上調(diào)了nscs中sox2蛋白的表達(dá)水平,westernblot檢測(cè)結(jié)果還表明,隨著nt-3濃度的增加,dcx蛋白表達(dá)水平也明顯增加,與對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);另外,50ng/ml及100ng/ml的nt-3同時(shí)促進(jìn)了Olig2蛋白表達(dá)水平的上調(diào)(P0.05)。其次,IF檢測(cè)結(jié)果顯示:對(duì)照組DCX陽(yáng)性(+)細(xì)胞的百分比最低,而各NT-3處理組DCX+細(xì)胞的百分比明顯增加(P0.05),并且細(xì)胞突起明顯增長(zhǎng),細(xì)胞之間的聯(lián)系更加廣泛;另外,50 ng/ml NT-3組和100 ng/ml NT-3組Olig2+細(xì)胞百分比較對(duì)照組也相應(yīng)增加(P0.05)。4.NT-3通過上調(diào)NSCs中p-Akt蛋白的表達(dá)而促進(jìn)Sox2蛋白表達(dá)的上調(diào),后者進(jìn)一步促進(jìn)了NSCs向神經(jīng)元方向的分化。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,100 ng/ml NT-3處理組的p-Akt蛋白表達(dá)水為最高,相應(yīng)地,Sox2、DCX蛋白表達(dá)水平也是最高(P0.05);為了證明PI3K/Akt通路介導(dǎo)NT-3上調(diào)Sox2的特異性,我們使用了特異性的通路阻斷劑LY294002(10 uM)來阻斷NT-3的作用,結(jié)果表明LY294002(10 uM)明顯下調(diào)了p-Akt及Sox2的蛋白表達(dá)水平,相應(yīng)地,DCX蛋白表達(dá)水平也被顯著下調(diào)(P0.05)。表明在NSCs中,NT-3通過上調(diào)Sox2而促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元方向分化是通過PI3K/Akt通路調(diào)控的。結(jié)論1.外源性的NT-3通過上調(diào)NSCs中Sox2的表達(dá)而促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元前體細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞方向的分化。2.NT-3通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路而調(diào)控Sox2的表達(dá)。3.NT-3上調(diào)Sox2的表達(dá)具有明顯的劑量依賴性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R651.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1541235