本文關(guān)鍵詞： 乳腺癌 熱休克蛋白 無疾病進(jìn)展 預(yù)后 乳腺腫瘤 熱休克蛋白 轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng) 凋亡　出處：《武漢大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分熱休克蛋白70在乳腺癌組織乳腺中的表達(dá)及臨床價(jià)值分析乳腺癌目前是我國女性最常見的惡性腫瘤,占癌癥死亡原因中位的第六位,嚴(yán)重威脅女性身心健康。隨著分子病理和分子生物學(xué)的發(fā)展,為進(jìn)一步提高乳腺癌早期診斷、綜合治療以及預(yù)后判斷的水平,尋找與乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物,在乳腺腫瘤領(lǐng)域開展了大量的臨床研究。與此同時(shí),研發(fā)針對(duì)生物學(xué)標(biāo)志相關(guān)靶點(diǎn)的抗癌藥物,也成為乳腺癌基礎(chǔ)與臨床研究熱點(diǎn),其中就包括熱休克蛋白在乳腺癌中的作用。本文通過定性和定量的方法,分析了熱休克蛋白70在不同乳腺組織類型中的表達(dá),及其與分子生物學(xué)之間的特征和關(guān)系,探討其是否為客觀預(yù)測(cè)乳腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo),為乳腺癌的診治及預(yù)后判斷提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的：觀察熱休克蛋白70在乳腺癌、不典型增生、癌旁組織和正常組織中的表達(dá),分析其與乳腺癌相關(guān)因素之間的關(guān)系。方法：收集經(jīng)手術(shù)切除病理確診的乳腺癌病例160例,獲得完整的臨床資料,分別應(yīng)用定性和定量方法,檢測(cè)HSP70在不同乳腺組織中的表達(dá),并分析其與乳腺癌相關(guān)因素的關(guān)系。結(jié)果：1.HSP70蛋白在乳腺癌組織中存在一定水平的表達(dá),且表達(dá)與腫瘤大小、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、HR狀態(tài)和Her-2狀態(tài)呈現(xiàn)明顯相關(guān)性,但和病理類型、月經(jīng)狀態(tài)、組織學(xué)分級(jí)無明顯相關(guān)性；同時(shí)HSP70的表達(dá)對(duì)無疾病進(jìn)展時(shí)間和總生存時(shí)間存在相關(guān)性：在HSP70陽性組(n=70),無疾病進(jìn)展時(shí)間為24.0月(95%CI：22.0-26.1月),而在HSP70陰性組(n=50),無疾病進(jìn)展時(shí)間33.0月(95%CI：29.8-36.2月),Log Rank=11.6, P=0.001。Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn),在HSP70陽性組(n=70),總體生存時(shí)間為32.0月(95%CI：26.8-37.2月),而在HSP70陰性組(n=50),總體生存時(shí)間為39.0月(95%CI：29.7-48.3月),Log Rank=6.9, P=0.012。2. Real-timePCR方法檢測(cè)HSP70 mRNA在乳腺癌和不典型增生中的表達(dá)明顯高于單純?nèi)橄僭錾?P0.05),但從不典型增生至乳腺癌的過程中HSP70的表達(dá)無明顯變化(P=0.82); HSP70mRNA的表達(dá)與腫瘤大小,病理類型,組織學(xué)分級(jí),PR狀態(tài),Her2狀態(tài),腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況無關(guān),與ER表達(dá)呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)rs=0.792,P0.001)。結(jié)論：HSP70在乳腺癌組織中有一定程度的表達(dá),HSP70陽性表達(dá)與乳腺癌病人預(yù)后較差有關(guān)。第二部分HSP70基因的表達(dá)對(duì)體外乳腺癌細(xì)胞株生物學(xué)功能的影響我們前期的研究顯示,HSP70的表達(dá)和乳腺癌的臨床病理特征有關(guān),是乳腺癌病人預(yù)后不良的指標(biāo)。為進(jìn)一步了解其作用的機(jī)制,我們應(yīng)用了基因轉(zhuǎn)錄方法檢測(cè)HSP70基因表達(dá)對(duì)體外乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株的抗增殖作用和生物學(xué)功能的影響：通過Western-blot和Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)HSP70mRNA在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)水平,并觀察比較轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力,黏附能力和形態(tài)學(xué)改變等生物學(xué)功能指標(biāo),為進(jìn)一步揭示HSP70在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的：探討熱休克蛋白70基因表達(dá)對(duì)體外乳腺癌細(xì)胞系生物學(xué)功能的影響。方法：構(gòu)建HSP70mRNA慢病毒載體,應(yīng)用基因轉(zhuǎn)錄方法檢HSP70基因表達(dá)對(duì)體外乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系的抗增殖作用和生物學(xué)功能的影響；通過Western-blot和Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)HSP70mRNA在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)水平,并通過MTT法,Transwen小室法、流失細(xì)胞技術(shù)和倒置顯微鏡等觀察比較轉(zhuǎn)染HSP70mRNA基因的MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力,黏附能力和形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果：1.含HSP70mRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞,HSP70的表達(dá)在mRNA和蛋白水平均明顯增強(qiáng),其HSP70蛋白的水平是未轉(zhuǎn)染組的2.7和3.5倍.2.MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231細(xì)胞的增殖活性,粘附能力明顯增強(qiáng)(p0.05)；倒置顯微鏡下觀察,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞,72h后生長狀況良好,未見明顯細(xì)胞減少,并可見陽性克��；流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞在加入藥物后24h、48h、72h后細(xì)胞凋亡率,其中48h后轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為1.17%,未轉(zhuǎn)染組為17.81%,空轉(zhuǎn)染組為19.80%(P0.05)；轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)48h后,劃痕邊緣的細(xì)胞逐漸進(jìn)入空白區(qū)域,培養(yǎng)72h后細(xì)胞“劃痕”基本愈合；高表達(dá)HSP70mRNA的轉(zhuǎn)染組細(xì)胞具有明顯的遷移和侵襲能力.結(jié)論：HSP70基因轉(zhuǎn)染對(duì)體外乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和抗凋亡的作用,導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,有可能是影響乳腺癌患者預(yù)后的因子之一。
[Abstract]:The first part and the clinical value of heat shock protein 70 in breast cancer breast tissue expression analysis of breast cancer is currently one of the most common malignant tumors in women, the sixth leading cause of cancer deaths accounted for, a serious threat to women's physical and mental health. With the development of molecular pathology and molecular biology, to further improve the early diagnosis of breast cancer. The level of comprehensive treatment and prognosis, and for breast cancer recurrence, metastasis related biomarkers in breast cancer has carried out a large number of clinical studies. At the same time, the anti-cancer drug development target for biological markers related to breast cancer, has become the basic and clinical research, including the effects of heat shock protein in breast cancer in this paper, through qualitative and quantitative methods, analysis of the heat shock protein 70 in different breast tissue type expression and molecular biology The characteristics and relationships, to discuss whether or not the objective prediction of breast cancer metastasis and prognosis of biological indicators, and provide experimental basis for diagnosis and prognosis of breast cancer. Objective: To observe the effect of heat shock protein 70 in breast cancer, atypical hyperplasia, the expression of adjacent tissues and normal tissues, analyze the relationship between related and the factors of breast cancer. Methods: surgically resected pathologically diagnosed 160 breast cancer patients were obtained with complete clinical data, using qualitative and quantitative methods, to detect the expression of HSP70 in different breast tissues, and analyze the relationship between the related factors of breast cancer. Results: the expression of 1.HSP70 protein in a certain level in breast cancer, and the expression and tumor size, number of metastatic lymph nodes, HR status and Her-2 status showed significant correlation, but with pathological type, menstrual status, histological grade of ignorance Significant correlation; and correlation of progression free and overall survival time and the expression of HSP70 in HSP70 positive group (n=70), progression free time was 24 months (95%CI:22.0-26.1 months), while in HSP70 negative group (n=50), progression free time of 33 months (95%CI: 29.8-36.2 months), Log Rank=11.6, P=0.001.Kaplan-Meier the analysis found that in HSP70 positive group (n=70), overall survival time was 32 months (95%CI:26.8-37.2 months), while in HSP70 negative group (n=50), overall survival time was 39 months (95%CI:29.7-48.3 months), Log Rank=6.9, HSP70 mRNA Real-timePCR method to detect the expression of P=0.012.2. in breast cancer and atypical hyperplasia was significantly higher than that of control breast hyperplasia (P0.05), but the expression of HSP70 from atypical hyperplasia to breast cancer in no significant change (P=0.82); the expression of HSP70mRNA and tumor size, pathological type, histological grade, PR status, He R2 status, axillary lymph node metastasis, it was positively correlated with ER expression (correlation coefficient rs=0.792, P0.001). Conclusion: HSP70 has a certain degree of expression in breast cancer tissues, the positive expression of HSP70 correlates with poor prognosis in breast cancer patients. Our previous expression of partial HSP70 gene second influence on the biological function of breast in vitro cancer cell lines showed that the expression of HSP70 and clinicopathological characteristics of breast cancer and poor prognosis of patients with breast cancer. In order to further understand the mechanism of the effect, we use the method to detect the gene transcription of HSP70 gene on the expression of MDA-MB-231 in breast cancer cells in vitro antiproliferative effect and biological function through the expression: to detect the level of HSP70mRNA Western-blot and Real-timePCR in MDA-MB-231 cells, and to observe the migration ability of MDA-MB-231 cells after transfection, cell adhesion Biological function index ability and morphological change, in order to further reveal the HSP70 in breast cancer in the development and provide experimental basis. Objective: To investigate the effect of heat shock protein 70 gene expression on the biological features of breast cancer cells in vitro. Methods: HSP70mRNA lentivirus vector construction, expression of application of gene transcription method to detect HSP70 the gene of breast cancer MDA-MB-231 cells in vitro anti proliferation and biological function; by detecting the expression level of HSP70mRNA Western-blot and Real-time PCR in MDA-MB-231 cells, and by MTT method, Transwen assay, cell migration ability loss of technology and inverted microscope observation and comparison of HSP70mRNA gene transfected MDA-MB-231 cells, changes of adhesion ability results: 1.. The morphological and HSP70mRNA containing lentiviral vector transfected MDA-MB-231 cells, HSP70. As at mRNA and protein levels were significantly increased, the level of HSP70 protein was 2.7 in non transfection group and 3.5 times by.2.MTT transfection group MDA-MB-231 cell proliferation and adhesion ability was significantly enhanced (P0.05); inverted microscope, transfected cells, 72h growth in good condition, no obvious cells decreased, and visible positive clones; flow cytometry in different transfection group MDA-MB-231 breast cancer cells in 24h after adding the drug, 48h, the rate of apoptosis of 72h cells, 48h transfected cells apoptosis rate was 1.17%, the untreated group was 17.81%, blanktransfected group was 19.80% (P0.05); transfected cells after 48h culture, scratch the edge of the cells gradually into the blank area, "scratch" 72h cells after healing; high expression of transfected cells with HSP70mRNA migration and invasion significantly. Conclusion: the transfection of HSP70 gene in breast cancer MDA-MB- in vitro 231 cell line has the effect of promoting cell proliferation, invasion and anti apoptosis, leading to tumor recurrence and metastasis. It may be one of the factors that affect the prognosis of breast cancer patients.

【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9

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