本文關(guān)鍵詞： 脊髓損傷 程序性壞死 Necrostatin-1 功能恢復(fù) 受體相互作用蛋白1 受體相互作用蛋白3 活性氧 線粒體　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:脊髓損傷是一種常見的高致殘率的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率大約是250-906/百萬人,其中美國的發(fā)病率最高。在中國據(jù)不完全統(tǒng)計,現(xiàn)有截癱患者約40萬人,且每年新增約1萬人。脊髓損傷主要見于年輕男性(發(fā)病高峰為30歲),常見的病因包括車禍外傷、工傷事故、運動損傷、墜落、暴力襲擊和戰(zhàn)傷等。脊髓損傷常導(dǎo)致持續(xù)的器官功能障礙和永久的神經(jīng)功能缺損,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量,而且需要高額的治療和護(hù)理費用,給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。盡管每年有大量的資金和人力投入到脊髓損傷的基礎(chǔ)和臨床研究中去,但收效甚微,到目前為止臨床上仍缺乏有效的治療藥物,如果能找到一種有效的治療脊髓損傷的藥物或研究方向?qū)⒕哂兄卮蟮囊饬x。脊髓損傷后的病理生理過程主要包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷,其中原發(fā)性損傷主要是指不可逆的機械性損害,如出血和傷灶細(xì)胞(包含神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等)被機械性破壞;而繼發(fā)性脊髓損傷主要包括興奮性中毒、氧化應(yīng)激、缺血、炎癥反應(yīng)、離子平衡和凋亡等。上述這些病理生理過程最終都將引起細(xì)胞死亡,進(jìn)而造成脊髓功能障礙。脊髓損傷后永久性的神經(jīng)功能障礙由兩者共同作用所造成的。因原發(fā)性損傷不可逆,也無法控制,所以目前對脊髓損傷的研究都集中在繼發(fā)性損傷。通過對繼發(fā)性損傷機制的深入了解,找到新的調(diào)控靶點進(jìn)而減輕繼發(fā)性損傷,從而促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)是當(dāng)前研究的難點和熱點。而脊髓損傷后繼發(fā)性損傷的病理生理過程中最基本和核心的問題就是細(xì)胞死亡,所以對脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞死亡機制的研究具有重大的意義。通常我們認(rèn)為細(xì)胞的死亡方式有三種類型:凋亡,自噬和壞死。凋亡是一種以細(xì)胞皺縮,染色質(zhì)濃縮、核碎裂和凋亡小體形成為主要特征的細(xì)胞死亡方式;自噬是由Ashford和Porter在1962年發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有"自己吃自己"的現(xiàn)象后提出的,表現(xiàn)為自噬小體形成的一種細(xì)胞死亡方式,主要是存在于機體的自我調(diào)節(jié),以實現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新;壞死的典型特征表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大,細(xì)胞器腫脹,質(zhì)膜破裂。長久以來壞死都被認(rèn)為是無序的、不可逆的并且無法被調(diào)控,所以脊髓損傷后細(xì)胞死亡的研究大多數(shù)是關(guān)于凋亡和自噬的。然而近十余年來越來越多的證據(jù)表明一部分壞死像凋亡一樣具有可調(diào)控的機制。首先一些研究發(fā)現(xiàn)在使用半胱氨酸蛋白酶(caspase)抑制劑后能使腫瘤壞死因子(TNF)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)而發(fā)生細(xì)胞壞死;2000年Holler等發(fā)現(xiàn)死亡受體Fas在受體相互作用蛋白1(RIP1)激活的情況下通過Fas和死亡受體結(jié)合可以引起不依賴caspase的非凋亡性的細(xì)胞死亡。這些研究表明一部分壞死可能和凋亡一樣是按照某種程序發(fā)生的,是可以調(diào)節(jié)的。2005年Degterev等合成了一種小分子物質(zhì)Necrostatin-1(Nec-1),其可以特異性抑制TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死,并將這種不同于一般細(xì)胞壞死的模式稱作"necroptosis",它一般被譯為程序性壞死。自此程序性壞死被用來描述這類由受體介導(dǎo)、不依賴caspase蛋白酶、高度調(diào)節(jié)的并具有典型壞死性細(xì)胞死亡形態(tài)的細(xì)胞死亡過程。而Nec-1也被作為一種識別程序性壞死的工具藥廣泛應(yīng)用于體內(nèi)和體外實驗中。RIPs是一類具有特異性的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白,它們具有共同的N端結(jié)構(gòu)域和不同的C端結(jié)構(gòu)域,在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活或死亡的信號通路中發(fā)揮著重要的作用。RIP1敲除的小鼠凋亡反應(yīng)在淋巴和脂肪組織中過度激活,出生數(shù)天后即死亡,證實了 RIP1的促進(jìn)細(xì)胞存活的作用。CD95L,TRAIL或者TNF+Z-VAD-FMK等無法誘導(dǎo)RIP1敲除的T細(xì)胞產(chǎn)生程序性壞死,同時在JurkatT細(xì)胞中RIP1過表達(dá)可誘導(dǎo)程序性壞死,這些研究則表明了 RIP1在促進(jìn)細(xì)胞死亡中的作用。所以RIP1既能傳遞促存活也能傳遞致死信號。RIP3擁有一個N末端KD結(jié)構(gòu)域,通過與RIP1的C末端RIP同源結(jié)合基序(RHIM)的結(jié)構(gòu)域結(jié)合。與RIP1不同,RIP3不參與NF-kB信號通路,它被認(rèn)為是腫瘤壞死因子I型受體(TNFR1)誘導(dǎo)程序性壞死發(fā)生中不可或缺的部分。2008年Degterev等發(fā)現(xiàn)Nec-1的作用靶點為RIP1。2009年三個獨立的研究小組同期在cell和science發(fā)表了 3篇關(guān)于RIP3蛋白功能的研究工作,進(jìn)一步揭示了 RIP激酶調(diào)控細(xì)胞壞死的分子機制。一系列的研究表明RIP1和RIP3是參與程序性壞死的關(guān)鍵分子蛋白,其相互作用是啟動程序性壞死的關(guān)鍵。程序性壞死的發(fā)生消耗能量,增加代謝,導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生大量的ROS,最終導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)壞死形態(tài)的死亡。而隨著研究的深人,人們發(fā)現(xiàn)程序性壞死參與了諸多臨床疾病,例如缺血再灌注損傷、病毒感染、創(chuàng)傷、腫瘤和炎癥等。程序性壞死可以加速腫瘤細(xì)胞死亡,增加其對抗腫瘤藥物的敏感性。一項關(guān)于兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病的研究發(fā)現(xiàn)程序性壞死有助于克服急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)的糖皮質(zhì)激素抵抗;紫草素可以誘導(dǎo)惡性上皮細(xì)胞及白血病細(xì)胞發(fā)生壞死,并且這一過程不被凋亡抑制劑(Z-VAD)和自噬細(xì)胞抑制劑(3-MA)所影響,但可被Nec-1完全抑制,表明其誘導(dǎo)的是程序性壞死而不是凋亡。而且在過表達(dá)P糖蛋白、BCL-xl和BCL-2等抗凋亡誘導(dǎo)蛋白后,紫草素的抗腫瘤作用并未減弱,進(jìn)一步說明其是通過程序性壞死發(fā)生作用。所有這些結(jié)果表明程序性壞死可能是腫瘤化療特別是具有化療抗藥性的腫瘤治療的一個新方向。敲除RIP3的細(xì)胞感染牛痘病毒后明顯更耐受激活的T細(xì)胞和TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,同時TNFα可以在缺乏Z-VAD-FMK的情況下誘導(dǎo)牛痘病毒感染的細(xì)胞發(fā)生程序性壞死,表明程序性壞死在病毒感染的細(xì)胞死亡中起著重要的作用。RIP3敲除的小鼠較野生型小鼠更易遭受病毒感染,表明機體通過誘導(dǎo)程序性壞死來清除病毒感染的細(xì)胞。上述結(jié)果表明程序性壞死可能參與抗病毒的機制。RIP3敲除的小鼠更耐受結(jié)腸和小腸的上皮細(xì)胞死亡和炎癥發(fā)生,表明RIP3調(diào)節(jié)的程序性壞死介導(dǎo)了腸炎的發(fā)生。Degterev等在小鼠大腦中動脈缺血模型中發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)程序性壞死參與了腦缺血再灌注后的損傷,通過Nec-1抑制程序壞死可保護(hù)神經(jīng)元,顯著減小壞死面積,促進(jìn)功能恢復(fù);King等和SU等均分別證明通過Nec-1抑制腦出血后的程序性壞死可顯著減輕腦水腫、減少出血量和促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù);You等在小鼠腦創(chuàng)傷模型中發(fā)現(xiàn)Nec-1抑制程序性壞死,可減輕腦組織損傷,促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。程序性壞死與脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞死亡的關(guān)系目前仍鮮有報道,脊髓損傷作為一種急性創(chuàng)傷性重癥疾病,早期神經(jīng)細(xì)胞的死亡形式更多的表現(xiàn)為壞死樣,所以壞死對脊髓損傷后功能恢復(fù)的影響可能較凋亡和自噬更大。如果脊髓損傷后大量的壞死細(xì)胞有一部是程序性壞死,是可調(diào)控的,將會加深我們對脊髓繼發(fā)性損傷的病理生理機制的理解。而抑制程序性壞死將會成為我們藥物研發(fā)的新方向,為脊髓損傷的藥物治療帶來新的曙光。因此本研究擬探討程序性壞死在小鼠脊髓繼發(fā)性損傷中的作用,深入認(rèn)識其發(fā)生發(fā)展的機制,為脊髓損傷治療的藥物開發(fā)提供新的靶點和思路。第一部分程序性壞死在小鼠實驗性脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞死亡中的作用研究目的:1.驗證程序性壞死參與了脊髓損傷后的繼發(fā)性損傷,是小鼠脊髓繼發(fā)性損傷中神經(jīng)細(xì)胞死亡一種重要的方式;2.探索Nec-1抑制程序性壞死后能否減輕脊髓繼發(fā)性損傷,及對下肢運動功能恢復(fù)的影響;方法:1.將健康成年雌性LCR小鼠隨機分為3組:1)sham組:僅僅切除椎板,充分暴露脊髓硬膜,不鉗夾脊髓;2)SCI+DMSO組:建立脊髓損傷模型后鞘內(nèi)給予4μl的DMSO;3)SCI+Nec-1組:建立脊髓損傷模型后鞘內(nèi)給予4μl的Nec-1(4mM);2.應(yīng)用血管夾鉗夾法建立小鼠脊髓損傷模型;3.通過PI活體標(biāo)記法評估各組小鼠脊髓組織內(nèi)24小時細(xì)胞壞死情況;4.通過HE染色評估各組小鼠脊髓損傷后24小時脊髓組織損傷程度;5.通過尼氏染色評估各組小鼠脊髓損傷后24小時脊髓組織內(nèi)神經(jīng)元存活情況;6.通過蛋白免疫印跡實驗檢測小鼠脊髓組織內(nèi)24小時Caspase3的表達(dá);7.通過TUNEL染色評估各組小鼠脊髓損傷后24小時脊髓組織內(nèi)細(xì)胞凋亡情況;8.通過Basso mouse scale(BMS)評估小鼠脊髓損傷后1、3、5、7、14和28天后肢運動功能的恢復(fù)情況。結(jié)果:1.與SCI+DMSO組相比,Nec-1能顯著減少小鼠脊髓損傷后24小時的PI染色陽性細(xì)胞數(shù)(PP0.05);2.在實驗性小鼠脊髓損傷后24小時,通過HE染色我們發(fā)現(xiàn)在損傷區(qū)域細(xì)胞大量壞死,形成典型的類似"海綿"的空洞狀結(jié)構(gòu)。SCI+DMSO組小鼠脊髓損傷灶面積較大(P0.05),Nec-1能減輕小鼠脊髓損傷后的組織損傷;3.在實驗性小鼠脊髓損傷后24小時,通過尼氏染色我們在SCI+Nec-1組較SCI+DMSO組小鼠脊髓組織中觀察到更多存活的神經(jīng)元(P0.05),表明Nec-1能減輕小鼠脊髓損傷后神經(jīng)元的死亡;4.蛋白免疫印跡實驗顯示脊髓損傷后24小時脊髓組織內(nèi)Caspase3的表達(dá)增高,但SCI+Nec-1組和SCI+DMSO組之間無明顯差異(P0.05),即Nec-1不影響小鼠脊髓損傷后的capase-3的表達(dá);5.TUNEL染色顯示脊髓損傷后24小時脊髓組織內(nèi)TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)在SCI+Nec-1和SCI+DMSO組之間無明顯差異(P0.05),即Nec-1不影響小鼠脊髓損傷后的細(xì)胞凋亡;6.在SCI+Nec-1組和SCI+DMSO組傷后28天內(nèi)均能觀察到后肢運動功能的緩慢恢復(fù)(BMS評分升高),且從傷后第7天開始Nec-1處理組運動功能改善更明顯,表明Nec-1能促進(jìn)脊髓損傷后肢運動功能恢復(fù)。結(jié)論:程序性壞死是小鼠脊髓損傷后一種重要的神經(jīng)細(xì)胞死亡方式,通過Nec-1特異性抑制程序性壞死可以減輕脊髓繼發(fā)性損傷,并促進(jìn)下肢運動功能恢復(fù);第二部分RIP1/RIP3通路在小鼠脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞程序性壞死中的作用目的:1.驗證RIP1/RIP3通路參與了小鼠脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞程序性壞死的過程;2.探索Nec-1抑制小鼠脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞程序性壞死的機制。方法:1.將健康成年雌性LCR小鼠隨機分為4組:1)sham組:僅僅切除椎板,充分暴露脊髓硬膜,不鉗夾脊髓;2)SCI組:建立脊髓損傷模型后不給予其它特殊處理;3)SCI+DMSO組:建立脊髓損傷模型后鞘內(nèi)給予4μ1的DMSO;4)SCI+Nec-1組:建立脊髓損傷模型后鞘內(nèi)給予4μ1的Nec-1(4mM)。2.應(yīng)用血管夾鉗夾法建立小鼠脊髓損傷模型;3.通過蛋白免疫印跡法評估脊髓損傷后組織內(nèi)6小時、12小時、24小時和48小時RIP1和RIP3的表達(dá)4.通過蛋白免疫印跡法評估Nec-1對脊髓損傷后24小時組織內(nèi)RIP1和RIP3表達(dá)的影響;5.通過免疫共沉淀評估傷后24小時不同組小鼠脊髓組織內(nèi)RIP1和RIP3的相互作用;6.檢測24小時脊髓組織內(nèi)一氧化氮、一氧化氮合成酶含量、氧化型谷胱甘肽/谷胱甘肽水平、丙二醛含量、ATP含量和ROS水平;7.通過電鏡觀察小鼠脊髓損傷24小時后脊髓組織神經(jīng)元線粒體損傷情況。結(jié)果:1.蛋白免疫印跡實驗顯示RIP1在小鼠脊髓組織內(nèi)有較高的表達(dá),實驗性脊髓損傷后仍維持在較高的表達(dá)水平,各時向點無明顯變化。而RIP3在正常脊髓組織內(nèi)表達(dá)相對較低,脊髓損傷后RIP3的表達(dá)水平顯著升高,但48小時內(nèi)各時相點間無顯著區(qū)別;2.在SCI+Nec-1組和SCI+DMSO組中,小鼠脊髓組織RIP1和RIP3表達(dá)無明顯差異(P0.05),即Nec-1不影響脊髓損傷后RIP1和RIP3的表達(dá);3.免疫共沉淀技術(shù)顯示脊髓損傷后24小時RIP1和RIP3的相互作用增強,而Nec-1能抑制損傷后24小時脊髓組織中RIP1和RIP3的相互作用;4.Nec-1能減少小鼠脊髓損傷后早期NO的產(chǎn)生、iNOS的表達(dá);Nec-1能減輕小鼠脊髓損傷后早期谷胱甘肽的氧化水平;Nec-1能減輕小鼠脊髓損傷后早期ATP的耗竭;Nec-1能減少小鼠脊髓損傷后早期MDA和ROS的含量。5.電鏡觀察顯示Nec-1能保護(hù)脊髓損傷后神經(jīng)元線粒體的超微結(jié)構(gòu);結(jié)論:程序性壞死是小鼠脊髓損傷后一種重要的細(xì)胞死亡方式,Nec-1對脊髓損傷后RIP1和RIP3的表達(dá)無明顯影響,而是通過抑制RIP1和RIP3的相互作用阻止壞死小體形成,進(jìn)而抑制程序性壞死,減輕脊髓繼發(fā)性損傷。Nec-1能降低ROS產(chǎn)物,減輕氧化應(yīng)激損傷,保護(hù)線粒體功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R651.2

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