本文關(guān)鍵詞： 組織工程室 血管再生 脂肪新生 脂肪組織提取物　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景和目的臨床上因?yàn)槟[瘤切除術(shù)后、先天性畸形及外傷等各種原因引起的軟組織缺損及因美容需求的軟組織填充是整形修復(fù)美容外科面臨的重大挑戰(zhàn)之一。2011年美國(guó)有近5百萬(wàn)例的修復(fù)重建手術(shù),78%為修復(fù)重建腫瘤切除術(shù)后的軟組織缺損。全球范圍內(nèi)每年大約有130萬(wàn)的乳腺癌新發(fā)病例,乳癌切除后必將造成大范圍軟組織缺損。為解決以上難題,真皮移植、人工合成材料、膠原注射劑及自體脂肪移植等被越來(lái)越多的的應(yīng)用于臨床工作中。而這些方法都有各自的缺點(diǎn)和不足,比如合成材料容易引起機(jī)體的異物反應(yīng)和感染；脂肪組織因能夠提供容量和輪廓支持而受到臨床醫(yī)生的青睞,但其吸收率高達(dá)30～50%,限制了其在臨床上的應(yīng)用；帶蒂脂肪瓣移植由于其移植后,應(yīng)用顯微外科技術(shù)即刻重建脂肪內(nèi)部的血液循環(huán),移植后體積縮小少,能取得移植的最佳效果,但帶蒂脂肪供區(qū)有限,切取大量脂肪后易導(dǎo)致供區(qū)繼發(fā)畸形,這限制了帶蒂脂肪瓣移植在臨床的應(yīng)用。近年來(lái)脂肪組織工程技術(shù)為解決軟組織缺損的修復(fù)提出了全新的思路。在脂肪組織工程中細(xì)胞、支架和微環(huán)境是三個(gè)主要因素,但不管是通過(guò)優(yōu)化種子細(xì)胞或者改性生物活性材料支架或者改善局部微環(huán)境,最終構(gòu)建的工程化脂肪組織,其體積都無(wú)法超過(guò)1ml,并且在組織構(gòu)成和組織穩(wěn)定上都難以達(dá)到滿意的結(jié)果。2003年Hofer SO等人移植軸型血管蒂到一個(gè)充滿膠原基質(zhì)的生物惰性材料制作有一定硬度的保護(hù)性容器內(nèi),為擬構(gòu)建的組織提供血運(yùn)基礎(chǔ)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)所需空間,生成了非特異性的肉芽組織,首先提出“血管化組織工程室”的概念。這種創(chuàng)新型的構(gòu)建模式為我們的組織工程研究大大拓寬了思路。隨著研究的深入,2007年Dolderer等人把帶血管蒂的腹壁脂肪瓣放入中空的小室內(nèi)植入老鼠的腹股溝皮下,發(fā)現(xiàn)脂肪組織顯著增長(zhǎng),組織形態(tài)學(xué)分析顯示增加的組織是正常的血管化成熟脂肪組織,形成了“脂肪組織工程室”。2011年將這種方法應(yīng)用到大動(dòng)物,體積最大達(dá)56.5ml,然而所產(chǎn)生的脂肪組織的體積未達(dá)到置入工程室的容積,生長(zhǎng)受到限制,并且組織形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其組織成分為；纖維結(jié)締組織、脂肪組織、血管、PLGA,并且纖維結(jié)締組織的量和脂肪組織的量是相同的。我們手術(shù)治療軟組織缺損的目的不僅僅是為了填充凹陷,更重要的是要形成具有自然外觀和美學(xué)功能,并且與身體周圍組織結(jié)合并長(zhǎng)期維持穩(wěn)定的自然組織。顯而易見(jiàn),脂肪組織工程內(nèi)所構(gòu)建的脂肪組織并不完全適合應(yīng)用于臨床實(shí)踐中。隨著深入的研究,目前認(rèn)為工程化脂肪組織的體積主要取決于：一、早期的快速血管化,這是限制組織工程技術(shù)最終構(gòu)建物體積以及組織結(jié)構(gòu)成熟的關(guān)鍵因素；二、可控降解、組織相容性良好的生物材料；三、利于符合構(gòu)建物發(fā)構(gòu)建物發(fā)展的微環(huán)境；四、穩(wěn)定的物理屏障以保障構(gòu)建物體積和組織形態(tài)的長(zhǎng)期穩(wěn)定。脂肪組織本身具有很獨(dú)特的生理結(jié)構(gòu),脂肪組織中除了豐富的血管網(wǎng)絡(luò)之外,90%的空間由高耗氧、高耗能的脂肪細(xì)胞構(gòu)成,同時(shí)作為機(jī)體重要的內(nèi)分泌器官,脂肪組織能分泌多種脂肪因子,并且擁有豐富的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子,同時(shí)參與了血管化和脂肪化的過(guò)程。Jertta-RiinaSarkanen等從成熟的脂肪組織中提取的脂肪組織提取物(ATE)包含各種成熟脂肪組織的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子,在體外能夠誘導(dǎo)血管生成和脂肪生成。那么能否在工程室內(nèi)局部增加一些促進(jìn)血管化或成脂化的因子促進(jìn)早期構(gòu)建組織的血管化這個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題,來(lái)改善組織工程室構(gòu)建物生長(zhǎng)受限的情況?是否能影響最終新生構(gòu)建物的組織形態(tài)和成熟程度呢?歸根結(jié)底來(lái)說(shuō),就是如何利用組織工程室模型,最終誘導(dǎo)較純化的工程化脂肪組織。圍繞這幾個(gè)科學(xué)問(wèn)題,本實(shí)驗(yàn)擬將脂肪組織提取物注入到兔組織工程室內(nèi),通過(guò)對(duì)組織工程室內(nèi)滲出液進(jìn)行生化檢測(cè)分析,揭示工程室內(nèi)環(huán)境的變化,而后觀察工程室內(nèi)構(gòu)建組織的組織學(xué)形態(tài)變化及血管化情況,探討通過(guò)加強(qiáng)早期的血管化,能否構(gòu)建較純化的工程化脂肪組織。方法1、脂肪組織提取物對(duì)血管和脂肪生成的誘導(dǎo)利用兔腹股溝的脂肪組織,將其分離培養(yǎng)24小時(shí),過(guò)濾,離心后提取上清液,ELISA檢測(cè)相關(guān)因子,并將脂肪來(lái)源干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞加入到中提取的脂肪組織提取物(ATE)中,觀察其對(duì)成脂化和成血管的作用2、脂肪組織提取物注入工程室內(nèi)觀察組織工程室內(nèi)構(gòu)建組織的變化構(gòu)建兔脂肪組織工程室模型,實(shí)驗(yàn)組：在模型構(gòu)建后將脂肪組織提取物1周后注入一側(cè)工程室內(nèi),對(duì)照組：另一側(cè)注入等量的生理鹽水。分別于不同時(shí)間點(diǎn)觀察脂肪組織工程室構(gòu)建物的大體及組織學(xué)變化過(guò)程,并檢測(cè)脂肪組織工程室滲出液中細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子的變化。3、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。兩組之間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；不同時(shí)間點(diǎn)的差異采用協(xié)方差分析。P值小于0.05說(shuō)明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1、脂肪組織提取物(ATE)加入到到聯(lián)合培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基中,血管形成實(shí)驗(yàn)顯示ATE組血管內(nèi)皮細(xì)胞形成連續(xù)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。ATE加入脂肪來(lái)源干細(xì)胞中(ASCs)的培養(yǎng)基中,油紅O染色顯示,ATE組ASCs在無(wú)成脂誘導(dǎo)的情況下,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的脂滴聚集。2、脂肪瓣的體積在注入ATE后3天、1周、2周、3周、4周、7周時(shí),早期構(gòu)建組織成膠凍狀,后期軟組織表面可見(jiàn)明顯包膜形成,觸之較韌。注入ATE后,實(shí)驗(yàn)組新生組織體積較對(duì)照組明顯增大3、在脂肪組織發(fā)展過(guò)程中開(kāi)始階段,對(duì)照組組和實(shí)驗(yàn)組均有大量新生小血管出現(xiàn)在間質(zhì)區(qū)域,實(shí)驗(yàn)組組比對(duì)照組新產(chǎn)生的小血管密度大。隨著時(shí)間推移,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組注入組新生組織邊緣纖維沉積中有大量新生血管島狀樣脂肪細(xì)胞新生,實(shí)驗(yàn)組中邊緣纖維沉積中有大量的新生的幼稚脂肪細(xì)胞,而對(duì)照組中只有零散的分布,脂肪新生提前,并且血管化逐漸成熟。后期兩組新生組織已形成正常的脂肪組織小葉樣結(jié)構(gòu)。觀察構(gòu)建物的外層形成的薄膜發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組新生脂肪組織邊緣包膜較對(duì)照組更薄,結(jié)構(gòu)排列更為規(guī)則4、CD31免疫組化發(fā)現(xiàn),早期血管新生和數(shù)量明顯增多,注入ATE后1周總的毛細(xì)血管的數(shù)量是最高的,并且實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組多。討論組織工程室模型誘導(dǎo)脂肪新生的模式可看作為獨(dú)特的脂肪組織創(chuàng)傷修復(fù)的過(guò)程。脂肪瓣從原位分離出帶蒂島狀脂肪瓣后,脂肪組織連續(xù)性被打破,從而導(dǎo)致正常血管功能受損。機(jī)體啟動(dòng)非特異性的創(chuàng)傷修復(fù),主要表現(xiàn)為三個(gè)相互獨(dú)立又相互重疊的時(shí)期：炎癥期,增殖期和組織重塑期。在小室內(nèi)的早期炎癥反應(yīng),大量組織液滲出,局限在小室內(nèi)部,形成暫時(shí)性的結(jié)構(gòu)性支撐。同時(shí),高密度的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞從血管中游離至填滿小室的組織間液中,并分泌大量促血管生成和趨化因子。這對(duì)血管生成和早期骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和增殖起到起始趨化的作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)最初被稱為血管通透性因子,它被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的強(qiáng)力刺激因子。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF-2)對(duì)于傷口愈合和血管生成很重要。作為血管生成的細(xì)胞因子,成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF-2)能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和毛細(xì)血管的形成,與此同時(shí),也刺激間充質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移。John A.Rophael等將VEGF、血小板來(lái)源生長(zhǎng)因子(PDGF-BB)、FGF-2混合后加入到含有單純血管蒂和Matrigel的小室中后發(fā)現(xiàn)加入的生長(zhǎng)因子作用于早期。纖維組織中細(xì)胞浸潤(rùn)的數(shù)量增加,這些細(xì)胞主要包括巨噬細(xì)胞、周細(xì)胞、各種前脂肪細(xì)胞族群。而其中巨噬細(xì)胞和周細(xì)胞與血管和脂肪的生成均有關(guān)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)加入促血管生成因子能促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)。主要原因是早期的新生血管不僅為局部組織提供氧氣和營(yíng)養(yǎng),還作為干細(xì)胞趨化遷移的主要途徑。因此早期更好地建立完善的血供能夠更好的促進(jìn)組織再生。ATE中包含成熟脂肪組織的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子,如VEGF、bFGF,白細(xì)胞介素-6(IL-6),胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1),瘦素,脂聯(lián)素等,而一些脂肪組織來(lái)源的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子也能刺激血管生成和脂肪組織擴(kuò)張所需的毛細(xì)血管網(wǎng)形成。我們將ATE注入小室內(nèi),發(fā)現(xiàn)早期小室內(nèi)新生組織間質(zhì)化明顯,滲出的組織液形成凝膠樣纖維蛋白原基質(zhì),出現(xiàn)明顯的血管新生。與此同時(shí),血管周圍出現(xiàn)許多幼稚脂肪細(xì)胞,提示機(jī)體間充質(zhì)干細(xì)胞募集遷移至小室組織并在局部微環(huán)境誘導(dǎo)下啟動(dòng)分化。隨著新生血管的逐漸成熟,并與機(jī)體固有血管形成完善的血管網(wǎng)絡(luò)后,炎癥反應(yīng)逐漸減輕,組織修復(fù)進(jìn)入增殖期。在實(shí)驗(yàn)組的這個(gè)階段中,我們觀察到大量新生血管網(wǎng)絡(luò)形成。在早期形成的纖維蛋白原基質(zhì)中出現(xiàn)大量孤島樣脂肪細(xì)胞分化增殖,并逐漸融形成新的脂肪小葉。不同分化階段的脂肪前體細(xì)胞和脂肪細(xì)胞依附于血管周形成脂肪新生的基礎(chǔ)。這個(gè)階段實(shí)驗(yàn)組更早的形成更多地島狀脂肪細(xì)胞新生,一方面可能因?yàn)檠装Y期時(shí)在ATE的促血管生成因子的作用下,更多更快的血管網(wǎng)絡(luò)在組織間液形成的纖維蛋白原基質(zhì)中形成,致使更多的間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)循環(huán)進(jìn)入小室內(nèi)參與脂肪組織誘導(dǎo)新生；另一方面可能因?yàn)樵谠鲋称贏TE中含有的促脂肪生成因子,如瘦素,胰島素樣生長(zhǎng)因子等,能更好的促進(jìn)趨化遷移來(lái)的間充質(zhì)干細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)向成脂系細(xì)胞方向的分化。隨著構(gòu)建組織的成熟進(jìn)入了重塑期,在血管生成的過(guò)程中伴隨著血管的重塑,這個(gè)過(guò)程中血流不通,這就解釋了為什么在注入ATE后2周對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組血管的密度下降。新生脂肪組織的結(jié)構(gòu)逐漸形成正常脂肪組織的小葉狀結(jié)構(gòu)工程室內(nèi)新生脂肪組織體積都小于工程室的實(shí)際體積,并且構(gòu)建組織的最外層包繞著一層致密的纖維包膜,目前工程室模型多采用硅膠材料小室,這層纖維包膜可能和隆胸時(shí)假體表面形成的包膜相似。對(duì)于包膜形成的原因尚不明確,可能是由填充材料的性質(zhì)、假體置入技術(shù)、假體表面的紋理、異物的存在(如手套上的滑石粉)、細(xì)菌感染等引起的,而對(duì)包膜攣縮的治療也是沒(méi)有固定的治療方案。包膜分3個(gè)細(xì)胞層,每層都有自己的血供。有文獻(xiàn)指出通過(guò)改善局部血管化能夠重塑鄰位組織,改善包膜質(zhì)地。有實(shí)驗(yàn)研究利用干細(xì)胞療法重建缺血組織血運(yùn)以減輕包膜攣縮。也有學(xué)者利用脂肪移植來(lái)減輕包膜攣縮的程度,可能是因?yàn)橹窘M織中的間充質(zhì)干細(xì)胞能分泌血管生成因子而促進(jìn)內(nèi)皮前體細(xì)胞進(jìn)入新形成的血管中,改善包膜局部的血供,從而減輕包膜攣縮的程度。通過(guò)組織學(xué)染色,我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組工程室內(nèi)新生組織最外層包膜比對(duì)照組薄,可能是因?yàn)樵缙诟玫难芑瘜?dǎo)致后期包膜變薄。而包膜反應(yīng)的減輕能夠減少對(duì)新生組織體積增大的束縛,致使后期新生組織進(jìn)一步增大。通過(guò)我們的實(shí)驗(yàn)對(duì)工程室內(nèi)滲出液的連續(xù)觀察,我們發(fā)現(xiàn)脂肪工程室內(nèi)組織滲出液中含有大量的生長(zhǎng)因子,注入ATE后滲出液中的生長(zhǎng)因子的濃度增大,這些組織液能提供能更好的促進(jìn)構(gòu)建物的血管化和成脂化,提供更好的環(huán)境來(lái)支持脂肪組織的生長(zhǎng)。脂肪組織工程室具有重要的的應(yīng)用前景,脂肪組織來(lái)源豐富,供區(qū)損傷小,工程室不僅為室內(nèi)組織提供了生長(zhǎng)所需的空間,而且構(gòu)建出的相對(duì)獨(dú)立的空間便于實(shí)驗(yàn)的干預(yù),局部應(yīng)用脂肪組織提取物,加速室內(nèi)組織的生長(zhǎng),又不影響全身的組織,這可能是未來(lái)利用組織工程室進(jìn)行體內(nèi)組織工程研究的重點(diǎn)。結(jié)論1、利用兔腹股溝脂肪墊提取的ATE能夠改善工程室內(nèi)的血管微環(huán)境,早期誘導(dǎo)大量血管網(wǎng)絡(luò)新生、成熟,更快建立完善血供,促進(jìn)脂肪組織新生。2、同時(shí)通過(guò)改善局部血管化減輕包膜反應(yīng),去除阻止新生組織體積進(jìn)一步增大的障礙,為構(gòu)建有利于臨床應(yīng)用的工程化的脂肪組織提供新的思路。
[Abstract]:In recent years , there are about 1.3 million new cases of breast cancer in the United States of America , which can provide the best results of transplantation . In recent years , the tissue engineering has been used in the treatment of soft tissue defects . adipose tissue extract ( ATE ) , which is extracted from mature adipose tissue , contains various mature adipose tissue growth factors and cytokines , which can induce angiogenesis and fat formation . In the experimental group , there was a significant increase in vascular endothelial cells in the experimental group . In the control group and the experimental group , there was a large amount of new small blood vessels in the experimental group . The growth factors and cytokines , such as VEGF , bFGF , interleukin - 6 ( IL - 6 ) , insulin - like growth factor - 1 ( IGF - 1 ) , leptin , adiponectin , etc . In order to reduce the degree of capsular contracture , it is possible to improve the blood supply in the tissue engineering chamber and to promote the growth of adipose tissue . In addition , it is possible to provide better environment for the development of tissue engineering .

【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R622

【共引文獻(xiàn)】

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1 馮超;李U，

本文編號(hào)：1479744