本文關鍵詞：富含BMP-2的PLGA材料制備及對兔關節(jié)軟骨缺損修復的應用研究　出處：《重慶醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的:骨和關節(jié)軟骨缺損的修復迄今尚未有一種理想的方法,而對前者的研究較多,對軟骨缺損的研究相對較少。臨床治療關節(jié)軟骨缺損常用軟骨成形術、骨髓刺激術等,由于修復的軟骨成分以纖維軟骨為多、短期效果尚可、但長期隨訪效果欠佳。間充質(zhì)干細胞的多方向分化潛能,一直是軟骨修復研究的熱點,但是對間充質(zhì)干細胞軟骨分化后的問題仍存在著的爭論。多能干細胞也用于軟骨缺損的修復,由于涉及倫理道德問題及長期使用發(fā)生腫瘤的風險,也阻礙了多能干細胞的進一步研究。支架材料同樣是研究的熱點,特別是天然材料,如水凝膠、膠原等,但存在植入體內(nèi)后機械強度差,降解時間難以控制等問題;人工合成高分子材料,如聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸(PGA),有容易出現(xiàn)局部酸中毒、過量加熱引起單體鏈解聚等問題;羥磷灰石等生物材料由于脆性大、塑性困難,較少用于軟骨修復中。組織工程方法特別是模仿自然軟骨形成步驟的方法目前是研究的熱點,但是對軟骨的構建離臨床的應用尚有很長一段距離。正是基于目前關節(jié)軟骨缺損的修復尚無“金標準”的情況下,本實驗希望能尋找到更理想的材料和方法,除了能夠通過實驗證明制備的材料對骨組織工程的應用可行性外,最主要的是希望材料能促進關節(jié)軟骨缺損的修復,為未來臨床的應用夯實基礎,這是本論文研究的目的和出發(fā)點。方法:1.制備骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)與磷脂復合物:BMP-2與磷脂按照不同的比例,溶解在有機化學溶劑中,經(jīng)過冷凍干燥形成復合物。2.采用溶液澆鑄法制備聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)和磷脂的復合物膜。3.檢測復合物的理化特征,包括:BMP-2的包封率、復合材料的靜態(tài)接觸角、吸水率、掃描電鏡下的形態(tài)、能量色譜儀分析等等,并對材料的BMP-2體外釋放能力通過透析法進行測定。4.PLGA-BMP-2-磷脂復合物與OCT-1成骨樣細胞聯(lián)合培養(yǎng),通過細胞粘附試驗、細胞增殖試驗、免疫組織化學分析、細胞堿性磷酸酶測定、實時定量熒光PCR分析等方法了解并比較制備的復合緩釋材料對細胞粘附、增殖、分化特別是長期生長的影響。5.制備新西蘭大白兔膝關節(jié)軟骨缺損實驗動物模型,將制備的復合物植入軟骨模型內(nèi),通過大體標本、組織學染色、核磁共振掃描等方法觀察并比較植入物修復關節(jié)軟骨缺損情況。結果:1.PLGA-BMP-2-磷脂復合物的包封率、靜態(tài)接觸角、吸水性、掃描電鏡形態(tài)及體外釋放試驗結果均明顯優(yōu)于試驗對照(PLGA-BMP-2)。特別是BMP-2的體外釋放,實驗組在長達30天觀察中仍有BMP-2表達,而對照組的釋放時間主要集中在開始釋放的最初3天。2.PLGA-BMP-2-磷脂復合物與細胞聯(lián)合培養(yǎng)結果顯示:實驗組促進了細胞的粘附與增殖,特別是長時間(7天)觀察,實驗組對細胞增殖的促進作用更加明顯(p0.01);對細胞免疫組化分析顯示實驗組能夠提高OCT-1細胞的Ⅰ型膠原表達;實驗組在長期觀察中(15天)顯示出對細胞堿性磷酸酶活性有更強的影響,與對照組有顯著的差異(p0.01);同樣在長期觀察中(15天),通過RT-PCR測定OCT-1細胞的成骨相關基因:骨鈣素(OCN)、膠原蛋白(COL)、骨橋蛋白(OPN)、RUNT相關轉錄因子2(RUNX2)的表達,均顯示實驗組與對照組有顯著性差異(p0.01),實驗組明顯上調(diào)了這些基因表達。3.動物關節(jié)軟骨缺損的體內(nèi)修復實驗結果顯示在2周、4周、8周、12周,經(jīng)過大體標本觀察、組織學檢查、MRI檢查均顯示出實驗組修復軟骨缺損的能力更強。特別是經(jīng)過長時期觀察(8周、12周),實驗組與對照組之間比較有顯著性差異(p0.01)。結論:1.磷脂增強了PLGA與BMP-2的結合能力,解決了既往PLGA/BMP-2復合物中BMP-2釋放過快的問題,證明了PLGA-BMP-2-磷脂復合物能夠達到BMP-2緩釋的目的。2.PLGA-BMP-2-磷脂復合物體外實驗證實復合物能夠促進OCT-1細胞的粘附、增殖,分化;尤其是對成骨細胞的長期增殖分化有明顯影響,證明了PLGA-BMP-2-磷脂復合物有更強的BMP-2緩釋能力,有能力應用于骨組織工程。3.PLGA-BMP-2-磷脂復合物植入動物關節(jié)缺損模型體內(nèi)后能夠促進關節(jié)軟骨缺損的修復,實驗組效果優(yōu)于對照組,證實了實驗組中BMP-2對軟骨修復有緩釋作用及動物體內(nèi)植入復合物的可行性。4.PLGA-BMP-2-磷脂復合物能夠為軟骨的修復提供一種新穎的復合生物材料。
[Abstract]:Objective: to repair bone and articular cartilage defects has not been an ideal method, and the former researches on cartilage defects are relatively few. Annuloplasty in the clinical treatment of articular cartilage defects commonly used in cartilage, bone marrow stimulation, the cartilage repair by fibrocartilage is much, short-term effect is acceptable, but long term follow-up effect. Mesenchymal stem cell pluripotency, is a research hotspot in the repair of cartilage, but cartilage mesenchymal stem cells after differentiation problems still exist in the debate. Pluripotent stem cells to repair soft bone defect, because of the risk of ethical problems and long-term use of tumor, but also hinder the further study of pluripotent stem cells. The same scaffold is a hotspot of research, especially the natural materials, such as collagen hydrogel, etc., but there is in vivo mechanical strength, degradation Time is difficult to control; synthetic polymer materials, such as polylactic acid (PLA) and polyglycolic acid (PGA), are prone to local acid poisoning, caused by excessive heating of single chain depolymerization problems; hydroxyapatite biomaterials such as brittleness, plastic difficult, less used in cartilage tissue engineering. Methods especially the method of imitating the natural cartilage formation step is currently the research focus, but the construction of cartilage from the clinical application is still a long distance. It is based on the repair of articular cartilage defects is the "gold standard" under the condition of this experiment, hoping to find more ideal materials and methods, in addition to through the experiment proves that the feasibility of preparation of materials for bone tissue engineering, the most important is that material can promote the repair of articular cartilage defects, and lay a solid foundation for future clinical application, this article research The purpose and starting point. Methods: 1. preparation of bone morphogenetic protein (BMP-2) and phospholipid complex: BMP-2 with phospholipid according to different proportion, dissolved in organic chemical solvents, freeze-dried forms.2. complexes were prepared by solution casting poly lactic acid glycolic acid copolymer (PLGA), bone morphogenetic protein (BMP-2) including physicochemical characteristics, complex membrane phospholipids and detection of.3. complexes: BMP-2 encapsulation efficiency, static contact angle of composite material, water absorption, scanning electron microscope, energy chromatograph analysis and so on, and in vitro BMP-2 on material release ability was determined by.4.PLGA-BMP-2- phospholipid complex OCT-1 and co cultured with osteoblast like cells by dialysis method, through cell adhesion test, cell proliferation assay, immunohistochemistry, cell alkaline phosphatase, real-time quantitative PCR analysis method to investigate and compare the preparation The compound sustained-release materials on cell adhesion, proliferation, differentiation, especially the long-term growth effects of.5. preparation of New Zealand rabbits knee articular cartilage defect animal model, were implanted into cartilage model complex preparation, the specimen, histological staining, nuclear magnetic resonance scanning method to observe and compare the implant repair of articular cartilage defect situation results: 1.PLGA-BMP-2- phospholipid complex encapsulation efficiency, static contact angle, water absorption, scanning electron microscope and the in vitro release test results were significantly better than the control test (PLGA-BMP-2). Especially the release of BMP-2 in vitro, the experimental group during the 30 day observation is still in the expression of BMP-2, while the control group concentrated release time at the beginning of the first 3 days of release of.2.PLGA-BMP-2- phospholipid complex and cell co culture results showed that: the experimental group promoted the adhesion and proliferation of cells, especially the long time (7 days) observation, Effect of experimental group on cell proliferation more obviously (P0.01) on cell; immunohistochemical analysis showed that the experimental group can improve the expression of type I collagen OCT-1 cells; the experimental group in the long-term observation (15 days) showed a stronger effect on cell alkaline phosphatase activity, there is a significant difference with the control group (P0.01); also in long-term observation in (15 days), the determination of OCT-1 cells into bone related genes by RT-PCR: Osteocalcin (OCN), collagen (COL), osteopontin (OPN), RUNT related transcription factor 2 (RUNX2) expression in the experimental group showed a significant difference with the control group (P0.01) the experimental group was significantly increased, the expression of these genes in vivo animal experimental results of.3. repair of articular cartilage defects in 2 weeks, 4 weeks, 8 weeks, 12 weeks, after gross observation, histological examination, MRI examination showed that the repair of cartilage defect in experimental group especially the ability. A long period of observation (8 weeks, 12 weeks), compared with a significant difference between the experimental group and the control group (P0.01). Conclusion: 1. phospholipid enhanced binding ability of PLGA and BMP-2, to solve the BMP-2 PLGA/BMP-2 complex in the previous release too quick, proved to.2.PLGA-BMP-2- phospholipid complex object PLGA-BMP-2- phospholipid composite can reach BMP-2 the release proved complex can promote OCT-1 cell proliferation, adhesion, differentiation; especially has obvious effect on osteoblast proliferation and differentiation of long-term, proved that the BMP-2 release ability of PLGA-BMP-2- phospholipid complexes have stronger ability, application in bone tissue engineering.3.PLGA-BMP-2- phospholipid complex animal implantation joint defect model in vivo can promote the repair of articular cartilage defects, the experimental group is better than the control group, BMP-2 was confirmed in the experimental group have sustained-release effect and animal implantation on cartilage repair The feasibility of the.4.PLGA-BMP-2- phospholipid complex into the complex can provide a novel composite biomaterial for the repair of cartilage.

【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R687;R318.08

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