本文關鍵詞：轉化生長因子β1基因修飾骨髓間充質干細胞的實驗研究

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【摘要】：第一部分比格犬骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定[目的]建立犬骨髓間充質干細胞(BMSCs)的體外分離、培養(yǎng)方法,并對骨髓間充質干細胞進行鑒定,選擇增殖分化能力最佳的BMSCs,以期為移植實驗提供基礎。[方法]無菌條件下行犬髂后上棘穿刺,抽取比格犬骨髓10ml,采用密度梯度分離和貼壁培養(yǎng)相結合的方法體外分離、培養(yǎng)和擴增犬BMSCs,并誘導BMSCs向成骨細胞方向分化。倒置相差顯微鏡觀察其形態(tài)學變化,繪制生長曲線,流式細胞儀檢測細胞表面標志物。[結果]原代和傳代的BMSCs貼壁生長,呈紡錘形、長梭形,漩渦狀排列、成集落生長,1、3、5代細胞生長曲線基本一致,增殖速度快。第3代BMSCs表面標志物CD29、CD44分子陽性,CD34分子陰性。成骨方向誘導形成的礦化結節(jié)茜素紅染色陽性,堿性磷酸酶(ALP)染色陽性。[結論]采用密度梯度分離和貼壁培養(yǎng)相結合的方法能夠有效分離和培養(yǎng)犬BMSCs,分離培養(yǎng)的BMSCs具有間充質干細胞標志性表面抗原,能夠向成骨細胞誘導分化,為移植實驗提供種子細胞。第二部分TGF-β1基因轉染BMSCs慢病毒載體的構建及其在BMSCs中的表達[目的]通過慢病毒載體系統(tǒng)將目的基因TGF-β1基因包裝并轉染BMSCs,觀察TGF-β1基因在BMSCs內的表達及對其增殖代謝的影響。[方法]利用基因轉染技術將TGF-β1基因定向克隆至慢病毒載體,構建TGF-β1基因重組質粒,質粒轉化后行PCR、酶切和測序鑒定。在脂質體LP2000的作用下轉染293T細胞,以實時熒光QPCR檢測慢病毒滴度,以合適MOI感染犬BMSCs。熒光顯微鏡下觀察TGF-β1蛋白表達情況,并以半定量RT-PCR及Western Blot檢測感染后犬BMSCs中TGF-β1 mRNA和蛋白表達情況。觀察轉染后BMSCs細胞增殖代謝能力。[結果]基因轉染技術構建TGF-β1重組慢病毒,經PCR、酶切及測序鑒定完全正確,轉染293T細胞能夠正確表達,重組慢病毒滴度為1×108TU/ml,慢病毒感染BMSCs最佳MOI值為10,構建的重組慢病毒感染BMSCS能高效表達TGF-β1基因。[結論]慢病毒介導的TGF-β1基因可成功轉染犬BMSCs并能高效穩(wěn)定表達。
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R617

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本文編號：1204780