本文關(guān)鍵詞：肌腱干細(xì)胞Sox9基因過(guò)表達(dá)對(duì)腱—骨愈合影響的研究

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【摘要】：目的:1.比較大鼠TSCs與BMSCs促進(jìn)腱骨愈合能力的大小,篩選出可以更好促進(jìn)腱骨愈合的種子細(xì)胞;2.將慢病毒介導(dǎo)的Sox9基因過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大鼠TSCs,構(gòu)建Sox9+/Scx+細(xì)胞,觀察其促進(jìn)腱骨愈合的效果。方法:1.沿用本課題組前期成熟的技術(shù),分離、培養(yǎng)大鼠TSCs與BMSCs并通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)和免疫熒光技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定;利用CCK-8法對(duì)TSCs與BMSCs在體外進(jìn)行增殖速度的比較,同時(shí)RT-PCR檢測(cè)二者成骨、成軟骨以及成肌腱的相關(guān)標(biāo)志物;通過(guò)在大鼠體內(nèi)建立跟腱-骨愈合模型,將24只大鼠隨機(jī)分為三組:TSC組、BMSC組及對(duì)照組;將細(xì)胞-纖維蛋白凝膠運(yùn)用到腱骨界面,用阿爾新藍(lán)及天狼星紅染色評(píng)價(jià)腱骨界面修復(fù)情況,以此來(lái)比較兩種細(xì)胞促進(jìn)腱骨愈合的能力的大小。2.根據(jù)空病毒對(duì)TSCs的轉(zhuǎn)染預(yù)實(shí)驗(yàn),選擇適合的MOI值;分組:TSC組(未轉(zhuǎn)染)、Lv(將慢病毒空載體轉(zhuǎn)染TSCs)組及Sox9組(將慢病毒介導(dǎo)的Sox9基因過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染TSCs);利用RT-PCR、WB及免疫熒光技術(shù)對(duì)Sox9表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),驗(yàn)證是否Sox9已在TSCs中過(guò)表達(dá);CCK-8法明確慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響;通過(guò)細(xì)胞高密度培養(yǎng)、WB和免疫熒光技術(shù)判斷轉(zhuǎn)染對(duì)TSCs分化的影響;通過(guò)在大鼠體內(nèi)建立跟腱-骨愈合模型,將細(xì)胞-纖維蛋白凝膠運(yùn)用到腱骨界面,用阿爾新藍(lán)及天狼星紅染色等組織學(xué)方法評(píng)價(jià)腱骨界面修復(fù)情況;同時(shí),Micro CT和體外熒光顯像技術(shù)評(píng)價(jià)慢病毒轉(zhuǎn)染的TSCs在體內(nèi)應(yīng)用的生物安全性;應(yīng)用力學(xué)牽拉儀評(píng)價(jià)生物力學(xué)的改變。結(jié)果:1.TSCs與BMSCs形態(tài)相似,均高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD90,同時(shí)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34、內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源干細(xì)胞標(biāo)志物CD31表達(dá)陰性;TSCs在體外的增殖速度顯著快于BMSCs;TSCs中成肌腱標(biāo)志物表達(dá)較高,成骨標(biāo)志物表達(dá)相對(duì)較低而成軟骨標(biāo)志物則與BMSCs相近;Micro CT掃描結(jié)果提示兩種細(xì)胞均可導(dǎo)致腱骨界面肌腱側(cè)異位骨化,但TSCs相對(duì)較輕;第4周和8周時(shí),TSCs可使腱骨界面形成更多的纖維軟骨細(xì)胞,同時(shí)使腱骨界面的膠原排列更整齊,成熟度更高。2.在轉(zhuǎn)染后72h,可以觀察到TSCs攜帶綠色熒光蛋白,同時(shí)RT-PCR、WB及免疫熒光結(jié)果均提示Sox9的表達(dá)升高;CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)OD值結(jié)果無(wú)明顯差異;通過(guò)細(xì)胞高密度培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)Sox9組細(xì)胞和DI組細(xì)胞有明顯的聚集現(xiàn)象;WB和免疫熒光提示Sox9組中成軟骨相關(guān)蛋白Col Ⅱ均顯著升高;Sox9組的異位骨化程度則要顯著高于對(duì)照組;Lv組中的心臟中看到了少量的熒光信號(hào),而在Sox9組中大鼠的肝臟、心臟以及腎臟中均發(fā)現(xiàn)了較強(qiáng)的熒光信號(hào);第2周時(shí),Sox9組纖維軟骨形成量與對(duì)照組并無(wú)顯著差異,而第4周時(shí)二者差異顯著;腱骨界面膠原排列整齊程度及成熟度Sox9組在第2、4周時(shí)均要顯著高于對(duì)照組;第2、4周時(shí),Sox9組的最大載荷與抗拉強(qiáng)度均要顯著高于對(duì)照組。結(jié)論:1.從大鼠肌腱組織與骨髓中分離、培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)鑒定具有干細(xì)胞特性。2.大鼠TSCs在體外培養(yǎng)時(shí)比BMSCs增殖速度更快,可能比BMSCs更利于腱骨界面的修復(fù)。3.在體內(nèi),大鼠TSCs對(duì)腱骨界面的組織學(xué)修復(fù)效果比BMSCs好。4.利用慢病毒介導(dǎo)的Sox9基因過(guò)表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染大鼠TSCs。5.TSCs過(guò)表達(dá)Sox9基因后引起細(xì)胞內(nèi)成軟骨相關(guān)的重要蛋白Ⅱ型膠原表達(dá)量也升高。同時(shí),過(guò)表達(dá)Sox9的TSCs在體外經(jīng)高密度培養(yǎng)具有成軟骨分化的趨勢(shì),并且趨勢(shì)比經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的TSCs更強(qiáng)。6.過(guò)表達(dá)Sox9基因的TSCs應(yīng)用到腱骨界面后可促進(jìn)腱骨界面的組織學(xué)修復(fù),并改善生物力學(xué)強(qiáng)度,但同時(shí)也增大了腱骨界面局部的異位骨化以及存在重要臟器轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R687.2

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