本文關(guān)鍵詞：早期雞胚活性粗提物對小鼠組織創(chuàng)傷修復(fù)的應(yīng)用研究

  更多相關(guān)文章： 雞胚干細(xì)胞 雞胚活性物 膏劑 創(chuàng)傷

【摘要】：本試驗(yàn)旨在研究早期雞胚細(xì)胞活性物代替哺乳動物胚胎干細(xì)胞在皮膚損傷修復(fù)方面的臨床應(yīng)用效果。在試驗(yàn)中對種蛋進(jìn)行孵化,提取早期雞胚細(xì)胞活性物,制備成藥膏應(yīng)用于動物創(chuàng)傷試驗(yàn),并通過同源性比對得出雞與小鼠在創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)的細(xì)胞生長因子的蛋白活性成分上具有高度同源性。本試驗(yàn)意義在于探討早期雞胚細(xì)胞活性物的臨床效果,為其在臨床應(yīng)用上提供新的思路和借鑒。1.早期雞胚細(xì)胞的分離及活性物的提取為了確定最佳孵化時間和條件,本試驗(yàn)采用新鮮種蛋在溫度為37℃,濕度為55%的培養(yǎng)箱中孵化,選取0h,24h,48h,72h的入孵蛋采用藥勺法分離原代細(xì)胞,向提取物滴加瑞氏-吉姆薩染色液。結(jié)果顯示,孵化72h是最佳分離時間。此期顯微鏡下可見早期的雞胚細(xì)胞形態(tài)較圓,似球形,細(xì)胞較小,核較大。為了確定雞胚活性物的提取方法,本試驗(yàn)將提取的雞胚原代細(xì)胞分別在液氮(-196℃),-80℃,-20℃條件下進(jìn)行反復(fù)凍融3次,并在37℃恒溫水浴鍋進(jìn)行融解。結(jié)果顯示:在液氮、-80℃的條件下觀察凍融后的細(xì)胞其裂解率為分別為87%和85%,差異不顯著,但是相對于-20℃裂解率70%,有顯著差異。-80℃對于液氮而言操作簡便,所以選取-80℃作為反復(fù)凍融條件提取雞胚活性物以備后續(xù)試驗(yàn)用。2.軟膏劑基質(zhì)的確定為了探索O/W型基質(zhì)軟膏的最佳制作配方和工藝,本試驗(yàn)通過對外觀性狀、耐寒與耐熱性試驗(yàn)、離心試驗(yàn)和p H值測定,篩選出適宜的乳化劑,經(jīng)正交試驗(yàn)確定最佳處方。最佳配方和工藝為硬脂酸10g,白凡士林5g,羊毛脂1.5g,冰片1.0 g,液體石蠟3g為油相,加熱至80℃;另稱取甘油5g,吐溫-80 5g,三乙醇胺0.7g,尼泊金乙酯0.06g,加蒸餾水調(diào)節(jié)油、水兩相至100g,加熱至85℃;待其完全溶解后,將油相緩慢加入水相中,不停地攪拌至乳化完全;當(dāng)基質(zhì)溫度降至40℃左右時,加入10g提取物。最后在制作的活體動物皮膚破損模型上涂抹制備的膏劑進(jìn)行刺激性試驗(yàn),結(jié)果表明此膏劑對皮膚無刺激性,可以在動物臨床實(shí)驗(yàn)上進(jìn)行應(yīng)用。3.動物創(chuàng)傷模型的建立為了探索早期雞胚細(xì)胞活性物軟膏對創(chuàng)傷修復(fù)的作用,構(gòu)建昆明小鼠刀切傷,燙傷和眼部損傷模型,皮膚表面涂抹制備的早期雞胚細(xì)胞活性物軟膏以及眼部滴加早期雞胚細(xì)胞活性提取物。結(jié)果顯示:在燙傷模型中,涂抹軟膏劑的傷口愈合比涂抹紅霉素軟膏組和對照組愈合快。在12d時,涂抹早期雞胚細(xì)胞活性物膏劑組的創(chuàng)面面積為0.62cm2,創(chuàng)面愈合率為60.16%,對照試驗(yàn)組小鼠的創(chuàng)面面積為1.13cm2,創(chuàng)面愈合率為26.50%,差異極顯著(p0.01);在刀切傷口組中,涂抹早期雞胚細(xì)胞活性物膏劑組與涂抹紅霉素軟膏組和空白實(shí)驗(yàn)組比較,其傷口愈合快,第7d時,涂抹自制膏劑組傷口長度為1.10cm,紅霉素軟膏組傷口長度為1.35cm,差異不顯著,但對照組傷口為1.58cm,愈合情況差異顯著(p0.05);在眼部損傷模型中,滴加早期雞胚細(xì)胞活性物提取液對小鼠眼部損傷具有修復(fù)作用,可抑制炎癥反應(yīng),并且具有促進(jìn)毛發(fā)生長的作用。本試驗(yàn)通過皮下注射、滴眼和皮膚表面涂抹不同的給藥方式,探究早期雞胚細(xì)胞活性物對小鼠機(jī)體的影響,測量小鼠體溫,其體溫上下波動均在0.5℃內(nèi),小鼠并未出現(xiàn)高熱、過敏等免疫排斥現(xiàn)象。因此,早期雞胚細(xì)胞活性物雖是異源物質(zhì),與小鼠存在較大的種族差異,但經(jīng)蛋白序列比對,b FGF同源性高達(dá)90%、EGF和SCF為53%、VEGF為78%、IGF為76%、TGF-β為56%、PDGF為80%,其細(xì)胞活性成分具有高度同源性,且對于創(chuàng)傷修復(fù)有促進(jìn)作用,可以應(yīng)用于臨床動物試驗(yàn)。
【關(guān)鍵詞】：雞胚干細(xì)胞 雞胚活性物 膏劑 創(chuàng)傷
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R641
【目錄】：

• 致謝4-11
• 摘要11-13
• 文獻(xiàn)綜述13-21
• 1 胚胎干細(xì)胞的研究進(jìn)展13-17
• 1.1 哺乳動物胚胎干細(xì)胞研究進(jìn)展13-14
• 1.2 禽類胚胎干細(xì)胞研究進(jìn)展14-15
• 1.2.1 雞的胚胎發(fā)育特點(diǎn)14-15
• 1.3 胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性15-16
• 1.3.1 ES細(xì)胞的全能性及多能性15
• 1.3.2 ES細(xì)胞的自我更新能力15-16
• 1.4 胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用前景16
• 1.4.1 ES細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化為特定細(xì)胞16
• 1.4.2 ES細(xì)胞在藥物安全性研究中的應(yīng)用16
• 1.4.3 ES細(xì)胞在移植與細(xì)胞替代療法中的應(yīng)用16
• 1.5 胚胎干細(xì)胞研究面臨的困難與挑戰(zhàn)16-17
• 1.5.1 ES細(xì)胞的建系17
• 1.5.2 胚胎干細(xì)胞成瘤性17
• 1.5.3 定向誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化17
• 1.5.4 移植后的免疫排斥反應(yīng)17
• 2 創(chuàng)傷修復(fù)的研究進(jìn)展17-19
• 2.1 創(chuàng)傷修復(fù)17-18
• 2.2 影響創(chuàng)傷修復(fù)的因素18
• 2.2.1 巨噬細(xì)胞18
• 2.2.2 血小板18
• 2.2.3 脂肪組織18
• 2.3 臨床上常用的創(chuàng)傷修復(fù)方法18-19
• 2.3.1 基因工程技術(shù)18-19
• 2.3.2 組織工程19
• 2.3.3 中草藥19
• 2.3.4 干細(xì)胞療法19
• 2.4 生長因子與創(chuàng)傷修復(fù)19
• 3 軟膏劑的制備工藝19-20
• 3.1 軟膏劑基質(zhì)的選擇19-20
• 3.2 乳化方法的選擇20
• 3.3 乳化溫度的選擇20
• 3.4 軟膏劑的初步穩(wěn)定性試驗(yàn)20
• 4 小結(jié)20-21
• 引言21-22
• 試驗(yàn)一 雞胚活性粗提物的分離提取22-26
• 1 材料與方法22-23
• 1.1 試驗(yàn)材料22
• 1.1.1 試驗(yàn)動物22
• 1.1.2 主要試劑22
• 1.1.3 主要儀器設(shè)備22
• 1.2 試驗(yàn)方法22-23
• 1.2.1 種蛋的培養(yǎng)22
• 1.2.2 X期雞胚胚盤細(xì)胞的分離與收集22-23
• 1.2.3 早期雞胚盤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒定23
• 1.2.4 早期雞胚盤細(xì)胞活性物的提取23
• 2 結(jié)果與分析23-24
• 2.1 不同時期種蛋發(fā)育情況23-24
• 2.2 早期雞胚盤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒定24
• 2.2.1 早期雞胚盤細(xì)胞電子顯微鏡下的鑒定24
• 2.3 不同條件下反復(fù)凍融后的雞胚盤細(xì)胞的比較24
• 2.4 早期雞胚細(xì)胞活性物的提取24
• 3 討論24-26
• 3.1 早期胚胎發(fā)育的特點(diǎn)24-25
• 3.1.1 早期胚胎干細(xì)胞的遷移24
• 3.1.2 種蛋孵化過程中營養(yǎng)物質(zhì)的變化24-25
• 3.2 細(xì)胞裂解方法的比較分析25
• 3.3 早期雞胚細(xì)胞活性物的釋放25-26
• 試驗(yàn)二 早期雞胚細(xì)胞活性物軟膏的制備26-32
• 1 材料與方法26-29
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料26
• 1.1.1 主要試劑26
• 1.1.2 主要儀器26
• 1.1.3 試驗(yàn)動物26
• 1.2 試驗(yàn)方法26-28
• 1.2.1 基質(zhì)類型的篩選26-27
• 1.2.2 軟膏基質(zhì)的篩選27
• 1.2.3 軟膏基質(zhì)配方確定27
• 1.2.4 試驗(yàn)方法27
• 1.2.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)27-28
• 1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)28
• 1.3.1 外觀觀察28
• 1.3.2 耐寒與耐熱性試驗(yàn)28
• 1.3.3 離心試驗(yàn)28
• 1.3.4 p H值測定28
• 1.4 主藥與基質(zhì)的配比28
• 1.5 刺激性試驗(yàn)28
• 1.6 早期雞胚細(xì)胞活性物軟膏劑的抗菌效果28-29
• 2 結(jié)果與分析29-30
• 2.1 軟膏基質(zhì)的優(yōu)選29
• 2.2 基質(zhì)比例的優(yōu)選29-30
• 2.3 軟膏劑基質(zhì)配方的確定30
• 2.4 藥物與基質(zhì)比例的優(yōu)選30
• 2.5 制備過程30
• 2.6 雞胚活性物軟膏劑的形態(tài)學(xué)觀察30
• 2.7 刺激性試驗(yàn)結(jié)果分析30
• 2.8 軟膏劑抗菌效果研究30
• 3 討論30-32
• 3.1 軟膏劑的制備工藝30-31
• 3.2 透皮促進(jìn)劑的作用31
• 3.3 工藝流程圖31-32
• 試驗(yàn)三 軟膏劑對小鼠組織創(chuàng)傷的修復(fù)作用32-40
• 1 試驗(yàn)材料與方法32-33
• 1.1 試驗(yàn)材料32
• 1.1.1 試驗(yàn)動物32
• 1.1.2 試劑32
• 1.1.3 主要儀器32
• 1.2 同源性分析32
• 1.3 試驗(yàn)前準(zhǔn)備32-33
• 1.3.1 試驗(yàn)動物的分組32
• 1.3.2 麻醉藥的使用32-33
• 2 實(shí)驗(yàn)方法33-34
• 2.1 小鼠燙傷模型的建立33
• 2.1.1 小鼠燙傷的治療33
• 2.2 小鼠刀切傷傷口模型的建立33-34
• 2.2.1 小鼠刀切傷傷口的治療33-34
• 2.3 小鼠創(chuàng)傷組織病理切片的制作34
• 2.3.1 病理切片的取材與處理34
• 2.3.2 在電子顯微鏡下觀察皮膚病理切片34
• 2.4 小鼠眼部損傷模型的建立34
• 3 結(jié)果與分析34-38
• 3.1 同源性分析結(jié)果34-35
• 3.2 燙傷組實(shí)驗(yàn)小鼠的生理狀態(tài)35-37
• 3.2.1 涂抹雞胚細(xì)胞活性物軟膏對燙傷愈合的影響35
• 3.2.2 涂抹紅霉素軟膏對燙傷愈合的影響35-36
• 3.2.3 對照試驗(yàn)組小鼠燙傷愈合情況36
• 3.2.4 燙傷組愈合時間及創(chuàng)面面積變化36
• 3.2.5 小鼠燙傷組織病理切片的分析36-37
• 3.3 傷口組實(shí)驗(yàn)小鼠的生理狀態(tài)37-38
• 3.3.1 涂抹雞胚干細(xì)胞活性物軟膏對傷口的愈合影響37
• 3.3.2 涂抹紅霉素軟膏對傷口的愈合影響37
• 3.3.3 對照試驗(yàn)組傷口的愈合影響37
• 3.3.4 各處理組傷口愈合情況分析37
• 3.3.5 小鼠傷口創(chuàng)傷組織病理切片的分析37-38
• 3.4 小鼠眼部損傷愈合情況38
• 3.5 不同給藥方式下小鼠體溫的變化情況38
• 4 結(jié)論38-40
• 4.1 雞胚活性提取物軟膏劑的安全性試驗(yàn)38
• 4.2 雞胚活性提取物軟膏劑對創(chuàng)傷修復(fù)的影響38-40
• 小結(jié)40-41
• 試驗(yàn)附圖41-49
• 參考文獻(xiàn)49-53
• Abstract53-54

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1125591