本文關鍵詞：共培養(yǎng)下內(nèi)皮祖細胞對背根神經(jīng)節(jié)細胞影響的實驗研究

  更多相關文章： 背根神經(jīng)節(jié) 內(nèi)皮祖細胞 共培養(yǎng) 軸突生長 慢性脊髓損傷

【摘要】：目的:1、分離SD乳鼠背根神經(jīng)節(jié),通過Neurobasal無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)高純凈度的背根神經(jīng)節(jié)細胞,為神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關實驗研究提供實驗基礎。2、通過梯度密度離心的方法提取骨髓源性單個核細胞,應用EGM-2 MV培養(yǎng)基誘導培養(yǎng),獲得高純度內(nèi)皮祖細胞,為內(nèi)皮系細胞的相關實驗研究提供基礎。3、通過建立內(nèi)皮祖細胞與背根神經(jīng)節(jié)細胞共培養(yǎng)體系,觀察共培養(yǎng)下內(nèi)皮祖細胞對DRG細胞突起生長的影響,為慢性脊髓損傷修復研究尋求新方向。方法:1、選取新生SD大鼠,消毒后在手術放大鏡下摘取背根神經(jīng)節(jié),搗碎后用胰蛋白酶消化,終止消化后用含100μg/ml鼠源性神經(jīng)生長因子、0.1mg/ml L-谷氨酰胺、2%B27添加劑及青鏈霉素的不含血清Neurobasal培養(yǎng)基制成單細胞懸液,接種在提前用多聚賴氨酸包被處理過的6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi),用Neurobasal無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后全量換成含5μmol/L阿糖胞苷的神經(jīng)細胞培養(yǎng)基純化培養(yǎng),48h后全量換成不含血清的Neurobasal培養(yǎng)基,之后每2d換液,每天在顯微鏡下觀察細胞生長,取培養(yǎng)第6d的背根神經(jīng)節(jié)細胞進行NSE免疫組織化學染色以行細胞鑒定。2、選取SD大鼠,消毒后在超凈臺內(nèi)剝離下股骨、脛骨,用Hanks Buffer沖洗髓腔獲得沖洗液,添加淋巴細胞分離液應用梯度密度離心法分離單個核細胞,用內(nèi)皮系細胞專項培養(yǎng)基(EGM-2 MV)制成單細胞懸液,接種到細胞培養(yǎng)瓶中誘導培養(yǎng)。96h后全量換液,后每3d換液,每日在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。取誘導培養(yǎng)第6d的細胞,應用流式細胞儀對細胞表面抗原CDl33、CD34、VEGFR-2的表達情況進行檢測,同時將培養(yǎng)至7d的細胞爬片通過熒光顯微鏡觀察細胞對Dil-ac-LDL的攝取及對FITC-UEA-1的結(jié)合能力,即分別從細胞形態(tài)學、細胞表面抗原表達和細胞功能學三個方面鑒定成功誘導培養(yǎng)出高濃度的內(nèi)皮祖細胞。3、分別按照實驗一、二中的步驟進行背根神經(jīng)節(jié)細胞和內(nèi)皮祖細胞的培養(yǎng),實驗組分別選取培養(yǎng)第7d后的內(nèi)皮祖細胞與培養(yǎng)第4d的背根神經(jīng)節(jié)細胞分別接種于Transwell上、下小室,中間隔以孔徑為0.3μm的聚碳酸脂膜。對照組Transwell上下室接種同實驗組大致等量的背根神經(jīng)節(jié)細胞。置于同一細胞培養(yǎng)箱中,每2d全量換一次液,每日在倒置相差顯微鏡下觀察兩組細胞的生長情況。在共培養(yǎng)后第2d、4d對實驗組與對照組的隨機選取10個視野,在倒置相差顯微鏡下進行觀察,通過Image J軟件進行計數(shù),計算細胞突起的數(shù)量、最長突起長度和平均突起長度。結(jié)果:1、接種后的細胞懸液混濁,內(nèi)有多量雜質(zhì)存在。鏡下觀察有神經(jīng)細胞、成纖維細胞和各種神經(jīng)膠質(zhì)細胞等。所有細胞呈圓形、體積較小,接種4h后可見部分細胞開始貼壁,神經(jīng)細胞胞體的周圍可見光暈。培養(yǎng)24h后細胞幾乎全部貼壁,可見神經(jīng)節(jié)細胞長出小的突起,可見到數(shù)個神經(jīng)細胞成島狀存在。培養(yǎng)48h后,神經(jīng)細胞體積較前變大,不規(guī)則形狀,周圍突起的數(shù)量增加,突起增粗變長。加入阿糖胞苷培養(yǎng)48h后,貼壁的細胞數(shù)明顯減少,可見體積較大的死亡成纖維細胞漂浮存在。繼續(xù)培養(yǎng),細胞胞體體積逐漸增大,突起變長并增粗,互相連接,神經(jīng)突起網(wǎng)絡變得稠密。培養(yǎng)第7d,神經(jīng)節(jié)細胞最為飽滿,突起極為豐富。繼續(xù)培養(yǎng)可見神經(jīng)節(jié)細胞不再飽滿,胞質(zhì)減少,突起停止生長,突起逐漸彎曲、回縮,突起之間的連接部分斷裂,培養(yǎng)液中可見漂浮的細胞碎片。培養(yǎng)6d后的細胞行nse免疫組織化學染色,陽性細胞的細胞質(zhì)被染成棕褐色。純度檢測結(jié)果示,純度可達90%左右。2、鏡下見剛接種的細胞均呈球形,折光性較強。培養(yǎng)2d后可見部分細胞貼壁,可見少量細胞呈短的梭形。培養(yǎng)4d后,出現(xiàn)細胞突起,突起延伸,偶然可見細胞集落形成,可見部分細胞呈線樣排列。培養(yǎng)7d后可見較多梭形細胞,有較明顯的集落形成,細胞呈典型的線樣排列。第14d可見內(nèi)皮祖細胞呈多角形,細胞集落之間相互相連,呈典型的鋪路石樣改變。單個核細胞經(jīng)過egm-2mv培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)7d后,通過流式細胞儀對細胞表面抗原表達情況進行檢測示:細胞表型表達情況符合已知內(nèi)皮祖細胞抗原的表達特點。培養(yǎng)第7d的爬片細胞攝取dil-ac-ldl的細胞胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色熒光,攝取fitc-uea-1的細胞胞質(zhì)被染成綠色熒光,合成圖像呈雙熒光染色陽性(黃色)的細胞陽性率70%。雙染陽性細胞陽性為內(nèi)皮細胞的前體。3、鏡下見培養(yǎng)1d后,實驗組與對照組相對比背根神經(jīng)節(jié)細胞胞體折光性較強,突起較多。培養(yǎng)2d、4d后,實驗組與對照組相對比可見背根神經(jīng)節(jié)細胞突起較長,細胞之間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更緊密。在細胞共培養(yǎng)的第2d、4d,細胞共培養(yǎng)組中細胞突起的數(shù)量、最長突起和平均突起長度均較對照組有明顯增長,兩組數(shù)據(jù)比較差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。結(jié)論:1、摘取新生乳鼠的背根神經(jīng)節(jié),用neurobasal培養(yǎng)基培養(yǎng),通過48小時后加入阿糖胞苷來抑制雜志細胞的生長,成功分離培養(yǎng)出了相對純凈度高的背根神經(jīng)節(jié)細胞。2、應用梯度密度離心法提取大鼠骨髓單個核細胞,接種后用egm-2mv培養(yǎng)基進行誘導,通過細胞形態(tài)學變化,表面抗原鑒定及細胞功能學鑒定,表明提取的單個核細胞經(jīng)誘導可以獲得多量高純度的內(nèi)皮祖細胞。3、共培養(yǎng)下EPCs能夠提高背根神經(jīng)節(jié)細胞突起的生長能力,說明內(nèi)皮祖細胞對背根神經(jīng)節(jié)的生長有一定的促進作用。這種促進作用很有可能是內(nèi)皮祖細胞分泌的一系列細胞因子協(xié)同作用的結(jié)果,這可為局部細胞移植治療慢性脊髓損傷提供研究基礎。
【關鍵詞】：背根神經(jīng)節(jié) 內(nèi)皮祖細胞 共培養(yǎng) 軸突生長 慢性脊髓損傷
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R651.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 縮略語/符號說明11-12
• 前言12-15
• 研究現(xiàn)狀、成果12-14
• 研究目的、方法14-15
• 一、SD乳鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞的分離培養(yǎng)鑒定15-24
• 1.1 對象和方法15-19
• 1.1.1 實驗材料15-17
• 1.1.2 實驗方法17-19
• 1.2 結(jié)果19-22
• 1.2.1 形態(tài)學觀察19-21
• 1.2.2 免疫化學染色及純度測定（NSE）21-22
• 1.3 討論22-23
• 1.4 小結(jié)23-24
• 二、內(nèi)皮祖細胞的提取誘導培養(yǎng)及鑒定24-34
• 2.1 材料和方法24-27
• 2.1.1 實驗材料24-25
• 2.1.2 實驗方法25-27
• 2.2 結(jié)果27-29
• 2.2.1 形態(tài)學觀察27-28
• 2.2.2 內(nèi)皮祖細胞表型鑒定28
• 2.2.3 細胞攝取Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1 的功能學鑒定28-29
• 2.3 討論29-33
• 2.4 小結(jié)33-34
• 三、內(nèi)皮祖細胞與背根神經(jīng)節(jié)細胞共培養(yǎng)34-40
• 3.1 對象和方法34-35
• 3.1.1 實驗材料34
• 3.1.2 實驗方法34-35
• 3.2 結(jié)果35-36
• 3.2.1 形態(tài)學觀察35
• 3.2.2 計數(shù)及測量35-36
• 3.3 討論36-39
• 3.4 小結(jié)39-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻41-45
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明45-46
• 綜述 內(nèi)皮祖細胞在慢性脊髓損傷修復中的研究46-56
• 綜述參考文獻51-56
• 致謝56-57
• 個人簡歷57

，

本文編號：1113998