本文關(guān)鍵詞：共培養(yǎng)下內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：目的:1、分離SD乳鼠背根神經(jīng)節(jié),通過(guò)Neurobasal無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)高純凈度的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,為神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。2、通過(guò)梯度密度離心的方法提取骨髓源性單個(gè)核細(xì)胞,應(yīng)用EGM-2 MV培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng),獲得高純度內(nèi)皮祖細(xì)胞,為內(nèi)皮系細(xì)胞的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供基礎(chǔ)。3、通過(guò)建立內(nèi)皮祖細(xì)胞與背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞共培養(yǎng)體系,觀察共培養(yǎng)下內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)DRG細(xì)胞突起生長(zhǎng)的影響,為慢性脊髓損傷修復(fù)研究尋求新方向。方法:1、選取新生SD大鼠,消毒后在手術(shù)放大鏡下摘取背根神經(jīng)節(jié),搗碎后用胰蛋白酶消化,終止消化后用含100μg/ml鼠源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子、0.1mg/ml L-谷氨酰胺、2%B27添加劑及青鏈霉素的不含血清Neurobasal培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液,接種在提前用多聚賴氨酸包被處理過(guò)的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),用Neurobasal無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后全量換成含5μmol/L阿糖胞苷的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基純化培養(yǎng),48h后全量換成不含血清的Neurobasal培養(yǎng)基,之后每2d換液,每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng),取培養(yǎng)第6d的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行NSE免疫組織化學(xué)染色以行細(xì)胞鑒定。2、選取SD大鼠,消毒后在超凈臺(tái)內(nèi)剝離下股骨、脛骨,用Hanks Buffer沖洗髓腔獲得沖洗液,添加淋巴細(xì)胞分離液應(yīng)用梯度密度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞,用內(nèi)皮系細(xì)胞專項(xiàng)培養(yǎng)基(EGM-2 MV)制成單細(xì)胞懸液,接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中誘導(dǎo)培養(yǎng)。96h后全量換液,后每3d換液,每日在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。取誘導(dǎo)培養(yǎng)第6d的細(xì)胞,應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面抗原CDl33、CD34、VEGFR-2的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)將培養(yǎng)至7d的細(xì)胞爬片通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞對(duì)Dil-ac-LDL的攝取及對(duì)FITC-UEA-1的結(jié)合能力,即分別從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面抗原表達(dá)和細(xì)胞功能學(xué)三個(gè)方面鑒定成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出高濃度的內(nèi)皮祖細(xì)胞。3、分別按照實(shí)驗(yàn)一、二中的步驟進(jìn)行背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)組分別選取培養(yǎng)第7d后的內(nèi)皮祖細(xì)胞與培養(yǎng)第4d的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分別接種于Transwell上、下小室,中間隔以孔徑為0.3μm的聚碳酸脂膜。對(duì)照組Transwell上下室接種同實(shí)驗(yàn)組大致等量的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。置于同一細(xì)胞培養(yǎng)箱中,每2d全量換一次液,每日在倒置相差顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。在共培養(yǎng)后第2d、4d對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的隨機(jī)選取10個(gè)視野,在倒置相差顯微鏡下進(jìn)行觀察,通過(guò)Image J軟件進(jìn)行計(jì)數(shù),計(jì)算細(xì)胞突起的數(shù)量、最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度和平均突起長(zhǎng)度。結(jié)果:1、接種后的細(xì)胞懸液混濁,內(nèi)有多量雜質(zhì)存在。鏡下觀察有神經(jīng)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和各種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。所有細(xì)胞呈圓形、體積較小,接種4h后可見部分細(xì)胞開始貼壁,神經(jīng)細(xì)胞胞體的周圍可見光暈。培養(yǎng)24h后細(xì)胞幾乎全部貼壁,可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞長(zhǎng)出小的突起,可見到數(shù)個(gè)神經(jīng)細(xì)胞成島狀存在。培養(yǎng)48h后,神經(jīng)細(xì)胞體積較前變大,不規(guī)則形狀,周圍突起的數(shù)量增加,突起增粗變長(zhǎng)。加入阿糖胞苷培養(yǎng)48h后,貼壁的細(xì)胞數(shù)明顯減少,可見體積較大的死亡成纖維細(xì)胞漂浮存在。繼續(xù)培養(yǎng),細(xì)胞胞體體積逐漸增大,突起變長(zhǎng)并增粗,互相連接,神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)變得稠密。培養(yǎng)第7d,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞最為飽滿,突起極為豐富。繼續(xù)培養(yǎng)可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞不再飽滿,胞質(zhì)減少,突起停止生長(zhǎng),突起逐漸彎曲、回縮,突起之間的連接部分?jǐn)嗔?培養(yǎng)液中可見漂浮的細(xì)胞碎片。培養(yǎng)6d后的細(xì)胞行nse免疫組織化學(xué)染色,陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)被染成棕褐色。純度檢測(cè)結(jié)果示,純度可達(dá)90%左右。2、鏡下見剛接種的細(xì)胞均呈球形,折光性較強(qiáng)。培養(yǎng)2d后可見部分細(xì)胞貼壁,可見少量細(xì)胞呈短的梭形。培養(yǎng)4d后,出現(xiàn)細(xì)胞突起,突起延伸,偶然可見細(xì)胞集落形成,可見部分細(xì)胞呈線樣排列。培養(yǎng)7d后可見較多梭形細(xì)胞,有較明顯的集落形成,細(xì)胞呈典型的線樣排列。第14d可見內(nèi)皮祖細(xì)胞呈多角形,細(xì)胞集落之間相互相連,呈典型的鋪路石樣改變。單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過(guò)egm-2mv培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后,通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面抗原表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)示:細(xì)胞表型表達(dá)情況符合已知內(nèi)皮祖細(xì)胞抗原的表達(dá)特點(diǎn)。培養(yǎng)第7d的爬片細(xì)胞攝取dil-ac-ldl的細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色熒光,攝取fitc-uea-1的細(xì)胞胞質(zhì)被染成綠色熒光,合成圖像呈雙熒光染色陽(yáng)性(黃色)的細(xì)胞陽(yáng)性率70%。雙染陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性為內(nèi)皮細(xì)胞的前體。3、鏡下見培養(yǎng)1d后,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相對(duì)比背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞體折光性較強(qiáng),突起較多。培養(yǎng)2d、4d后,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相對(duì)比可見背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞突起較長(zhǎng),細(xì)胞之間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更緊密。在細(xì)胞共培養(yǎng)的第2d、4d,細(xì)胞共培養(yǎng)組中細(xì)胞突起的數(shù)量、最長(zhǎng)突起和平均突起長(zhǎng)度均較對(duì)照組有明顯增長(zhǎng),兩組數(shù)據(jù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:1、摘取新生乳鼠的背根神經(jīng)節(jié),用neurobasal培養(yǎng)基培養(yǎng),通過(guò)48小時(shí)后加入阿糖胞苷來(lái)抑制雜志細(xì)胞的生長(zhǎng),成功分離培養(yǎng)出了相對(duì)純凈度高的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。2、應(yīng)用梯度密度離心法提取大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞,接種后用egm-2mv培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo),通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,表面抗原鑒定及細(xì)胞功能學(xué)鑒定,表明提取的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)可以獲得多量高純度的內(nèi)皮祖細(xì)胞。3、共培養(yǎng)下EPCs能夠提高背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞突起的生長(zhǎng)能力,說(shuō)明內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)背根神經(jīng)節(jié)的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。這種促進(jìn)作用很有可能是內(nèi)皮祖細(xì)胞分泌的一系列細(xì)胞因子協(xié)同作用的結(jié)果,這可為局部細(xì)胞移植治療慢性脊髓損傷提供研究基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：背根神經(jīng)節(jié) 內(nèi)皮祖細(xì)胞 共培養(yǎng) 軸突生長(zhǎng) 慢性脊髓損傷
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R651.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明11-12
• 前言12-15
• 研究現(xiàn)狀、成果12-14
• 研究目的、方法14-15
• 一、SD乳鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定15-24
• 1.1 對(duì)象和方法15-19
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料15-17
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法17-19
• 1.2 結(jié)果19-22
• 1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察19-21
• 1.2.2 免疫化學(xué)染色及純度測(cè)定（NSE）21-22
• 1.3 討論22-23
• 1.4 小結(jié)23-24
• 二、內(nèi)皮祖細(xì)胞的提取誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定24-34
• 2.1 材料和方法24-27
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料24-25
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法25-27
• 2.2 結(jié)果27-29
• 2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察27-28
• 2.2.2 內(nèi)皮祖細(xì)胞表型鑒定28
• 2.2.3 細(xì)胞攝取Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1 的功能學(xué)鑒定28-29
• 2.3 討論29-33
• 2.4 小結(jié)33-34
• 三、內(nèi)皮祖細(xì)胞與背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞共培養(yǎng)34-40
• 3.1 對(duì)象和方法34-35
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料34
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法34-35
• 3.2 結(jié)果35-36
• 3.2.1 形態(tài)學(xué)觀察35
• 3.2.2 計(jì)數(shù)及測(cè)量35-36
• 3.3 討論36-39
• 3.4 小結(jié)39-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-45
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明45-46
• 綜述 內(nèi)皮祖細(xì)胞在慢性脊髓損傷修復(fù)中的研究46-56
• 綜述參考文獻(xiàn)51-56
• 致謝56-57
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷57

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本文編號(hào)：1113998