發(fā)布時(shí)間：2017-10-28 13:14

  本文關(guān)鍵詞：Rho激酶參與氫氣保護(hù)LPS誘導(dǎo)離體人結(jié)腸上皮屏障功能障礙的機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 膿毒癥 腸屏障 富氫培養(yǎng)基 緊密連接蛋白 Rho 激酶

【摘要】：目的膿毒癥是感染所致的嚴(yán)重威脅生命的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)。膿毒癥常繼發(fā)于創(chuàng)傷、大手術(shù)等重大應(yīng)激事件,可發(fā)生于各個(gè)年齡段的患者。膿毒癥發(fā)生率、病死率高,幸存者也常因?yàn)椴l(fā)癥和后遺癥而導(dǎo)致生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。腸屏障的破壞一直以來被認(rèn)為是引發(fā)膿毒癥感染和多器官功能障礙綜合征(MODS)的始動(dòng)因素之一。腸屏障的構(gòu)成錯(cuò)綜復(fù)雜,是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分,因此日益成為膿毒癥研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。氫氣是大氣層中自然存在的氣體,人體中也有微量的氫以分子形式存在。文獻(xiàn)報(bào)道,一定濃度的氫氣對(duì)多種疾病有治療作用,并已經(jīng)通過許多模型證實(shí)。氫氣治療的具體機(jī)制目前還不十分明確。Rho激酶(ROCK)是一種絲/蘇氨酸激酶,廣泛存在于哺乳動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi),參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)。本研究旨在探究氫氣對(duì)膿毒癥離體人腸上皮細(xì)胞屏障功能的影響,以及Rho激酶是否參與了氫氣的作用機(jī)制。方法人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2,培養(yǎng)于無菌含20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,傳代培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期用于實(shí)驗(yàn)研究。第一部分:用Transwell小室建立Caco-2單層細(xì)胞屏障模型,或?qū)⒓?xì)胞接種到96孔板或6孔板中。實(shí)驗(yàn)分為6組:對(duì)照組(C組)、0.1mg/L細(xì)菌脂多糖(LPS)處理組(L1組)、1mg/L LPS處理組(L2組)、10mg/L LPS處理組(L3組)、50mg/L LPS處理組(L4組)、100mg/L LPS處理組(L5組)。處理24h后通過檢測(cè)跨上皮電阻值(TEER)和FITC-右旋糖酐通過率來觀察Caco-2單層細(xì)胞屏障完整性和通透性的改變,MTT法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,Western Blot法檢測(cè)處理24h后腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)水平。根據(jù)結(jié)果選擇能滿足實(shí)驗(yàn)需要的LPS處理濃度。第二部分:同第一部分建立細(xì)胞模型,實(shí)驗(yàn)分為5組:對(duì)照組(C組)、富氫培養(yǎng)基組(H組)、細(xì)菌脂多糖(LPS)處理組(L組)、富氫培養(yǎng)基+LPS處理組(HL組)、ROCK抑制劑(Y-27632)+LPS處理組(YL組)。對(duì)照組與富氫培養(yǎng)基組分別加入等容量DMEM空白高糖培養(yǎng)基和0.6mmol/L富氫培養(yǎng)基。LPS處理濃度為50mg/L,Y-27632處理濃度為25μmol/L。分別于0h、6h、12h、24h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)跨上皮細(xì)胞電阻值(TEER)和24h FITC-右旋糖酐通過率,MTT法檢測(cè)處理24h后細(xì)胞凋亡水平,Western Blot法檢測(cè)6h、12h、24h細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1和ROCK蛋白的表達(dá)水平,實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)檢測(cè)處理6h、12h、24h后Caco-2細(xì)胞ZO-1 m RNA和ROCK m RNA表達(dá)水平,細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)處理24h后Caco-2細(xì)胞ZO-1蛋白分布變化。結(jié)果第一部分:與對(duì)照組相比,0.1mg/L LPS未能引起跨上皮電阻值和FITC-右旋糖酐通過率的顯著改變和Caco-2細(xì)胞凋亡水平的顯著上升(P0.05),也未能顯著降低Caco-2細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)(P0.05);1mg/L和10mg/L濃度的LPS能引起跨上皮電阻值和FITC-右旋糖酐通過率的顯著改變(P0.05),并顯著增加Caco-2細(xì)胞凋亡(P0.05),但未能顯著降低Caco-2細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)(P0.05);50mg/L和100mg/L濃度的LPS既能降低跨上皮電阻值,增加FITC-右旋糖酐通過率(P0.05),即破壞了單層細(xì)胞屏障的完整性,增加其通透性;也顯著增加了Caco-2細(xì)胞的凋亡(P0.05),并降低了Caco-2細(xì)胞間ZO-1蛋白的表達(dá)(均P0.05)。因此本研究選用50mg/L的LPS處理濃度。第二部分:與對(duì)照組比較,LPS顯著降低了跨上皮電阻,增加了FITC-右旋糖酐通過率,降低了ZO-1 m RNA和蛋白表達(dá),并引起了ROCK m RNA和蛋白的過表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。LPS引起主要分布于Caco-2細(xì)胞間的ZO-1蛋白向細(xì)胞內(nèi)聚集,而細(xì)胞膜上的ZO-1蛋白分布減少,分布的連續(xù)性被破壞。與LPS處理組比較ROCK抑制劑Y-27632或富氫培養(yǎng)基的加入弱化了LPS對(duì)跨上皮電阻值和FITC-右旋糖酐通過率的影響(P0.05);富氫培養(yǎng)基改善了LPS引起的Caco-2細(xì)胞凋亡增加的情況(P0.05),ROCK對(duì)LPS引起的Caco-2細(xì)胞凋亡增加無顯著影響(P0.05);ROCK抑制劑或富氫培養(yǎng)基抑制了LPS對(duì)ZO-1 m RNA和蛋白的下調(diào),降低了LPS誘導(dǎo)的ROCK m RNA和蛋白過表達(dá),并減弱了ZO-1蛋白從Caco-2細(xì)胞膜上向細(xì)胞質(zhì)中再分布的情況,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05),提示富氫培養(yǎng)基和ROCK抑制劑均能減弱LPS對(duì)腸細(xì)胞屏障的破壞作用。富氫培養(yǎng)基+LPS處理組中,ROCK m RNA和蛋白表達(dá)水平較LPS處理組下降,說明ROCK蛋白可能參與了氫氣對(duì)腸細(xì)胞屏障的保護(hù)作用。結(jié)論LPS能直接損傷離體腸上皮屏障,氫氣能顯著緩解LPS對(duì)腸上皮屏障的損傷作用。Rho激酶可能參與了氫氣對(duì)腸屏障的保護(hù)效應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：膿毒癥 腸屏障 富氫培養(yǎng)基 緊密連接蛋白 Rho 激酶
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R614
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說明12-14
• 前言14-17
• 研究現(xiàn)狀及成果14-15
• 研究目的和方法15-17
• 第一部分 不同濃度細(xì)菌脂多糖對(duì)Caco-2 單層細(xì)胞屏障功能的影響17-31
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料17-20
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及器材17-18
• 1.1.2 主要試劑18-19
• 1.1.3 主要液體及其配制19-20
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法20-26
• 1.2.1 Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)20-21
• 1.2.2 富氫培養(yǎng)基的制備21
• 1.2.3 利用Transwell小室建立Caco-2 單層細(xì)胞屏障模型21-22
• 1.2.4 分組及處理22-26
• 1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析26
• 1.3 結(jié)果26-30
• 1.4 小結(jié)30-31
• 第二部分 富氫培養(yǎng)基對(duì)LPS誘導(dǎo)的Caco-2 單層細(xì)胞屏障功能障礙的保護(hù)和ROCK在其中的作用31-49
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料31-35
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及器材31-32
• 2.1.2 主要試劑32-34
• 2.1.3 主要液體及其配制34-35
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法35-40
• 2.2.1 Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)35
• 2.2.2 富氫培養(yǎng)基的制備35
• 2.2.3 Caco-2 單層細(xì)胞屏障的建立35
• 2.2.4 分組及處理35-39
• 2.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析39-40
• 2.3 結(jié)果40-48
• 2.4 小結(jié)48-49
• 討論49-57
• 結(jié)論57-58
• 創(chuàng)新點(diǎn)和局限性58-59
• 參考文獻(xiàn)59-67
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明67-68
• 綜述 ROCK與腸上皮屏障的研究及進(jìn)展68-78
• 綜述參考文獻(xiàn)73-78
• 致謝78-80
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷80

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 Lena Antoni;Sabine Nuding;Jan Wehkamp;Eduard F Stange;;Intestinal barrier in inflammatory bowel disease[J];World Journal of Gastroenterology;2014年05期

，

本文編號(hào)：1108374