本文關(guān)鍵詞：胃泌素釋放肽受體拮抗劑在小鼠肝缺血再灌注損傷中的保護作用

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【摘要】：研究目的肝缺血再灌注(ischemia and reperfusion,I/R)損傷是肝移植,肝切除手術(shù),創(chuàng)傷,失血性休克和心肺復(fù)蘇等臨床常見并發(fā)癥,嚴重影響患者的預(yù)后。然而,肝I/R損傷的內(nèi)在分子機制尚未完全明確,目前研究證據(jù)表明,當發(fā)生肝I/R損傷時,復(fù)雜的內(nèi)在因素,例如活性氧(Reactive oxygen species,ROS),趨化因子和炎性細胞因子,導(dǎo)致中性粒細胞浸潤、炎癥反應(yīng)與肝細胞損傷。但目前用于防止肝I/R損傷的治療策略并不是最優(yōu)化的。胃泌素釋放肽(gastrin-releasing peptide,GRP)是一種活性神經(jīng)肽,與其受體胃泌素釋放肽受體(gastrin-releasing peptide receptor,GRPR)相互作用后可促進細胞生長,參與免疫功能調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能,已有研究表明GRP-GRPR在膿毒癥、膽囊炎等炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用,通過阻斷GRP-GRPR反應(yīng)可以抑制炎癥發(fā)展,改善免疫功能失常狀態(tài)。那么,GRP-GRPR在小鼠肝I/R模型中發(fā)揮何種作用,阻斷GRP與GRPR反應(yīng)能否改善肝I/R損傷尚未見報道。因此,本研究擬建立部分肝缺血再灌注損傷小鼠模型,觀察GRP和GRPR在小鼠肝臟中的表達情況;探索GRPR拮抗劑RC-3095對小鼠肝I/R損傷的保護作用,并探索其可能的作用機制。研究方法1、將C57BL/6小鼠按照再灌注時間隨機分為假手術(shù)組(sham,n=6)和I/R 3h組(3h,n=6)、I/R 6h組(6h,n=6)、I/R 12h組(12h,n=6)、I/R 24h組(24h,n=6),I/R組小鼠建立70%肝組織I/R損傷模型,缺血時間均為60min;sham組小鼠僅剖腹探查,并不做肝門部血管結(jié)扎處理。在缺血60min,再灌注3h,6h,12h和24h不同時間點時,各組小鼠于七氟醚麻醉下心臟穿刺采血,并獲取缺血部分肝臟組織,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法測定小鼠血清和肝組織中GRP的表達水平;蛋白質(zhì)免疫印記法(Western-blotting,WB)測定肝臟組織中GRPR蛋白的表達水平。2、將C57BL/6小鼠隨機分為三組:假手術(shù)組(sham,n=6)、I/R組(I/R,n=6)以及RC-3095組(RC-3095,n=6)。缺血60min時,RC-3095組小鼠予以皮下注射RC-3095(3 mg/kg,150μl),sham組及I/R組小鼠皮下注射同等體積生理鹽水。注射后進行再灌注,6h后,七氟烷麻醉下心臟穿刺采血處死,并獲取各組小鼠缺血部分肝臟組織,(1)生化檢測儀測定血清AST、ALT濃度;(2)HE染色后評估肝組織形態(tài)學(xué)改變;(3)檢測肝臟髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性,評估肝組織氧化應(yīng)激和中性粒細胞浸潤程度;(4)ELISA檢測細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平;(5)采用TUNEL(Td T-mediated d UTP nick end labeling)法檢測缺血肝細胞凋亡情況。3、另取32只C57BL/6小鼠,分組情況同2,再灌注時間為6h,12h,24h,七氟烷麻醉下心臟穿刺采血處死小鼠后,肝組織經(jīng)勻漿、蛋白定量后,WB法檢測核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)活化和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、p38-MAPK(mitogen-activated protein kinase,MAPK)磷酸化水平。結(jié)果1、GRP和GRPR表達:肝臟缺血60min,再灌注3h,小鼠肝組織中GRP便升高且達到峰值,持續(xù)到再灌注后6h(P0.01),隨后逐漸降低,但12h和24h時與sham組仍存在顯著差異;血清中,GRP 3h時也顯著升高,6h達到峰值(P0.01),隨后開始下降,12h和24h時與sham組并無顯著差異;肝組織GRPR在再灌注3h時表達上調(diào),6h后也達到峰值(P0.05),隨后開始降低,12h和24h表達與Sham組小鼠并無統(tǒng)計學(xué)差異。2、RC-3095干預(yù)后,與I/R組相比較,RC-3095組小鼠肝損傷改變?nèi)缦?血清AST、ALT顯著降低(P0.01);HE染色顯示肝臟細胞腫脹減輕,炎癥反應(yīng)降低,中性粒細胞浸潤減少(P0.01);TUNEL染色顯示肝細胞凋亡明顯減少(P0.01);MPO酶活性顯著減弱(P0.01);血清和缺血肝臟組織中TNF-α、IL-6和IL-1β表達水平下調(diào)(P0.01),IL-10無改變,提示RC-3095改善了肝I/R后肝臟的損傷和炎癥反應(yīng)。3、GRP-GRPR參與肝臟I/R損傷的機制探討顯示:RC-3095組小鼠肝臟NF-κB活性比I/R組減弱,并JNK、ERK、p38磷酸化水平降低(P0.01)。結(jié)論1、GRP-GRPR在小鼠肝I/R損傷中顯著上調(diào);2、GRPR拮抗劑RC-3095顯著抑制肝I/R后的炎癥反應(yīng)和肝細胞壞死,從而改善肝損傷;3、GRPR拮抗劑RC-3095抑制小鼠肝I/R損傷后的NF-κB活性,并抑制JNK、ERK、p38-MAPK磷酸化,提示GRP可能通過NF-κB和p38/JNK/ERK通路調(diào)節(jié)肝I/R損傷的炎癥反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：肝缺血再灌注損傷 胃泌素釋放肽 胃泌素釋放肽受體 胃泌素釋放肽受體拮抗劑
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R657.3
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 縮略詞表11-13
• 前言13-15
• 材料與方法15-28
• 結(jié)果28-40
• 討論40-44
• 全文總結(jié)44-45
• 參考文獻45-50
• 文獻綜述 胃泌素釋放肽在炎性疾病中的作用50-58
• 參考文獻55-58
• 發(fā)表論文和參與科研工作情況58-59
• 致謝59-60

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本文編號：1104312