本文關(guān)鍵詞：高表達(dá)TrkC的神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)脊髓缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：在過(guò)去的五十年里,心血管外科技術(shù)取得了很大的進(jìn)展,手術(shù)成功率得到了很大的提高。然而,心臟大血管手術(shù)相關(guān)的并發(fā)癥以及由此導(dǎo)致的死亡率仍然較高。一些重癥患者的手術(shù),如復(fù)雜先天性心臟病和主動(dòng)脈瘤病變累及主動(dòng)脈弓部等,這些手術(shù)難度大、操作復(fù)雜,而且需要在手術(shù)過(guò)程中暫時(shí)中斷腦、脊髓的正常血液供應(yīng)。因阻斷主動(dòng)脈而導(dǎo)致的脊髓缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI),是嚴(yán)重的術(shù)后并發(fā)癥,對(duì)患者的預(yù)后、生活質(zhì)量和心理造成嚴(yán)重傷害。因此,如何防治神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥是心臟大血管手術(shù)面臨的重要課題。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)脊髓IRI的機(jī)制進(jìn)行的研究表明,脊髓IRI的發(fā)生和發(fā)展有多種因素參與,包括興奮性氨基酸、一氧化氮、自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化、胞內(nèi)鈣超載以及細(xì)胞凋亡等。應(yīng)激反應(yīng)是脊髓IRI的主要損傷機(jī)制,應(yīng)激狀態(tài)刺激熱休克蛋白70(Heat shock protein 70,Hsp70)快速大量合成與釋放。Hsp70是熱休克蛋白家族(Heat shock proteins,HSPs)的重要成員之一,它參與蛋白質(zhì)折疊、亞基的組成、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸以及蛋白質(zhì)降解等過(guò)程,在應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用。針對(duì)脊髓IRI的機(jī)制,目前認(rèn)為心臟大血管手術(shù)中脊髓的保護(hù)手段除了提高手術(shù)技術(shù)、保證脊髓血供以及腦脊液引流等措施以外,NSCs移植有望成為修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變的重要療法。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,中樞神經(jīng)損傷后神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量不可逆地減少,導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙難以恢復(fù)。直到1992年,Reynolds和Weiss成功從成年小鼠的紋狀體發(fā)現(xiàn)了NSCs,這種細(xì)胞具有自我更新和分裂增殖能力,可以分化為神經(jīng)系統(tǒng)大部分類型的細(xì)胞,對(duì)損傷和疾病具有反應(yīng)能力,提示成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)也有自我修復(fù)能力。然而,中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身修復(fù)不足以恢復(fù)神經(jīng)功能。隨著近年對(duì)NSCs研究的深入,越來(lái)越多的證據(jù)提示基因修飾的NSCs移植療法有望應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(Neurotrophin-3,NT-3)能促進(jìn)NSCs生存、遷移和向脊髓內(nèi)具有的神經(jīng)元類型分化,酪氨酸激酶C(Tyrosine kinase C, TrkC)是NT-3的高親合力受體,負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)NT-3的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。NT-3通過(guò)與TrkC的胞外區(qū)結(jié)合,將神經(jīng)細(xì)胞存活和分化的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)部,促進(jìn)NSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞。然而,由于一般的NSCs不能穩(wěn)定表達(dá)足夠數(shù)量的TrkC,因此通過(guò)基因修飾NSCs來(lái)增加其TrkC的表達(dá)有望提高其在受損脊髓內(nèi)的存活率,促進(jìn)其向各種神經(jīng)細(xì)胞的分化和向遠(yuǎn)處遷移。因此,本研究擬通過(guò)轉(zhuǎn)染TrkC基因制備高表達(dá)TrkC的NSCs,并移植到大鼠脊髓IRI模型中,探討高表達(dá)TrkC的NSCs對(duì)脊髓IRI的作用及機(jī)制。本研究分兩部分進(jìn)行,第一部分以大鼠胎腦海馬組織NSCs作為來(lái)源細(xì)胞,通過(guò)轉(zhuǎn)染TrkC基因制備高表達(dá)TrkC的NSCs。第二部分建立大鼠脊髓IRI模型,將NSCs和高表達(dá)TrkC的NSCs分別移植到脊髓損傷部位,觀察大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能、脊髓組織病理改變以及血清Hsp70的改變,探討高表達(dá)TrkC的NSCs移植對(duì)脊髓IRI的作用及可能機(jī)制。第一章：大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)與高表達(dá)TrkC的神經(jīng)干細(xì)胞的制備目的：在體外分離、培養(yǎng)和鑒定大鼠NSCs,并通過(guò)轉(zhuǎn)染TrkC基因制備高表達(dá)TrkC的NSCs。方法：(1)選擇孕14d Wistar大鼠,取出胎鼠腦海馬組織,機(jī)械消化成單細(xì)胞懸液,在含生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng),傳代后使用。通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)鑒定NSCs。(2)通過(guò)設(shè)計(jì)和合成TrkC引物,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,通過(guò)酶切與連接獲得pMD18-T-TrkC質(zhì)粒。(3)NSCs分為三組,、對(duì)照組不作處理；空載體組為轉(zhuǎn)染空載體的NSCs;高表達(dá)組為使用pMD18-T-TrkC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的NSCs。(4)通過(guò)RT-PCR和Western blot檢測(cè)比較三組細(xì)胞的TrkC的表達(dá)。結(jié)果：原代培養(yǎng)細(xì)胞均為圓形亮球狀,第3d開始貼壁分化,細(xì)胞漸漸變?yōu)樗笮?伸出突起；第6d出現(xiàn)大量神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,突起交織成網(wǎng)狀。RT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果提示,與對(duì)照組和空載體組相比,通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TrkC的NSCs明顯高表達(dá)TrkC。結(jié)論：大鼠胎腦海馬組織能分離出NSCs,以質(zhì)粒為載體、脂質(zhì)體為介導(dǎo)可成功制備高表達(dá)TrkC的NSCs。第二章：高表達(dá)TrkC的NSCs對(duì)脊髓缺血再灌注損傷的作用及對(duì)Hsp70的影響目的：探討高表達(dá)TrkC的NSCs移植對(duì)脊髓缺血再灌注損傷的作用及對(duì)Hsp70的影響。方法：選取45只Wistar大鼠,雌雄不拘,采用左腎靜脈下阻斷腹主動(dòng)脈的方法構(gòu)建脊髓缺血損傷模型,隨機(jī)分為3組：(1)阻斷組,只進(jìn)行阻斷腹主動(dòng)脈；(2)NSCs移植組,阻斷腹主動(dòng)脈術(shù)后1d移植普通NSCs到受損脊髓；(3)TrkC-NSCs移植組,阻斷腹主動(dòng)脈術(shù)后1d移植高表達(dá)TrkC的NSCs到受損脊髓。每組于移植術(shù)后1 d、2 d、3 d、7 d及14 d分別選3只大鼠采用改良Tarlov評(píng)分進(jìn)行后肢運(yùn)動(dòng)功能,然后收集尾靜脈血進(jìn)行ELISA檢測(cè)Hsp70蛋白濃度,最后處死大鼠取脊髓標(biāo)本,進(jìn)行組織病理學(xué)檢查,包括HE染色、TUNEL染色及凋亡指數(shù)計(jì)算,以及尼氏染色。計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析,功能評(píng)分采用非參數(shù)檢驗(yàn)。結(jié)果：45只Wistar大鼠全部建模成果并存活。后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分結(jié)果顯示,術(shù)后7d,TrkC-NSCs移植組評(píng)分均明顯高于阻斷組(P0.05)；術(shù)后14d,NSCs移植組評(píng)分均明顯高于阻斷組,TrkC-NSCs移植組評(píng)分均明顯高于另外兩組(P均0.05)。組織病理學(xué)結(jié)果顯示,術(shù)后5個(gè)時(shí)間點(diǎn)中,各組大鼠脊髓組織細(xì)胞形態(tài)在術(shù)后7d時(shí)差異最為明顯,阻斷組脊髓神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)腫脹,大量細(xì)胞凋亡,尼氏小體減少；TrkC-NSCs移植組神經(jīng)細(xì)胞及其細(xì)胞器的形態(tài)最接近正常,凋亡細(xì)胞最少；NSCs移植組神經(jīng)細(xì)胞及凋亡數(shù)量介于上述兩組之間。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,各組大鼠移植術(shù)后Hsp70蛋白水平均升高,于術(shù)后3d達(dá)到峰值,TrkC-NSCs移植組各時(shí)間點(diǎn)的Hsp70水平均高于另外兩組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.01)。結(jié)論：NSCs移植對(duì)脊髓損傷有保護(hù)作用,且高表達(dá)TrkC的NSCs的保護(hù)效果更佳,其機(jī)制可能是替代受損神經(jīng)細(xì)胞,以及促進(jìn)Hsp70的釋放而減輕應(yīng)激反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：脊髓缺血再灌注損傷 神經(jīng)干細(xì)胞 TrkC基因 熱休克蛋白70
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R654
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-13
• 前言13-19
• 第一章 大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)與高表達(dá)TrkC的神經(jīng)干細(xì)胞的制備19-34
• 引言19
• 1. 材料與方法19-30
• 1.1 主要試劑與器材19-20
• 1.2 NSCs的分離和培養(yǎng)20-21
• 1.3 NSCs的鑒定21
• 1.4 高表達(dá)TrkC的NSCs的制備21-27
• 1.5 RT-PCR檢測(cè)TrkC基因表達(dá)水平27-29
• 1.6 Western Blot檢測(cè)TrkC基因表達(dá)水平29-30
• 2. 結(jié)果30-31
• 3. 討論31-33
• 4. 結(jié)論33-34
• 第二章 高表達(dá)TrkC的神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)脊髓缺血再灌注損傷后熱休克蛋白70的影響34-53
• 引言34
• 1. 材料與方法34-44
• 1.1 主要試劑與器材34-35
• 1.2 動(dòng)物模型的建立與分組35-37
• 1.3 NSCs移植37
• 1.4 后肢運(yùn)動(dòng)功能觀察37
• 1.5 ELISA檢測(cè)血清Hsp70蛋白水平37-38
• 1.6 脊髓組織取材38-39
• 1.7 HE染色39-41
• 1.8 細(xì)胞凋亡檢測(cè)41-43
• 1.9 尼氏染色43
• 1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法43-44
• 2. 結(jié)果44-48
• 2.1 后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分結(jié)果44-45
• 2.2 HE染色結(jié)果45-46
• 2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果46-47
• 2.4 尼氏小體染色結(jié)果47
• 2.5 Hsp70蛋白水平檢測(cè)結(jié)果47-48
• 3. 討論48-52
• 4. 結(jié)論52-53
• 全文總結(jié)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-62
• 英文縮略詞表62-63
• 成果63-65
• 致謝65-66

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本文編號(hào)：1103367