發(fā)布時間：2017-10-18 14:09

  本文關鍵詞：PPARγ基因干擾腺病毒載體重組及鑒定

  更多相關文章： PPARγ 腺病毒 干擾 腦損傷 炎癥反應

【摘要】：目的:構建PPARγ基因干擾腺病毒載體,為PPARγ基因在創(chuàng)傷性腦損傷中的功能研究及分子機制闡述奠定基礎。方法:針對人源PPARγ基因設計4條siRNA,采用脂質(zhì)體轉染方法導入LN229細胞中,利用RT-PCR技術檢測基因干擾效果,確定一條干擾效果最好的siRNA鏈用人工合成方式合成兩端帶Sfi酶切位點的shRNA,用Sfi酶切pAd-pSES-HUS質(zhì)粒,用T4連接酶將shRNA連接到pAd-PSES-HUS質(zhì)粒中,用Pmel和EcoRV雙酶切重組質(zhì)粒驗證,將正確克隆的穿梭質(zhì)粒用Pmel線性化后轉到BJ5183與骨架質(zhì)粒pAdeasy1同源重組成腺病毒質(zhì)粒。Pacl酶切驗證,將正確重組的質(zhì)粒轉入HEK293細胞中包裝腺病毒,提取病毒顆粒測定滴度并感染LN229細胞,采用RT-PCR和Western-blot驗證重組病毒干擾功能。結果:(1)成功構建pAd-pSES-HUS-PPARγ-shRNA穿梭質(zhì)粒。(2)得到正確同源重組的腺病毒質(zhì)粒。(3)成功制備具有干擾PPARγ基因的腺病毒顆粒。結論:本實驗中成功構建具備干擾PPARγ基因的腺病毒顆粒,為PPARγ基因在炎癥反應中功能研究奠定基礎。
【關鍵詞】：PPARγ 腺病毒 干擾 腦損傷 炎癥反應
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R651.15;Q78
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 摘要7-8
• ABSTRACT8-10
• 前言10-13
• 1 材料13-16
• 1.1 主要試劑13-14
• 1.2 主要儀器14-15
• 1.3 重要試劑配制15-16
• 1.4 實驗對象16
• 2 方法16-26
• 2.1 PPARγ 基因siRNA設計及合成16
• 2.2 LN229細胞復蘇培養(yǎng)與凍存16-17
• 2.3 siRNA轉染17
• 2.4 mRNA水平檢測17-19
• 2.4.1 細胞總RNA提取17-18
• 2.4.2 RT-PCR反應18-19
• 2.5 PSES-HUS-PPARγsiRNA重組質(zhì)粒構建19-22
• 2.5.1 shRNA合成19
• 2.5.2 DH5α 感受態(tài)制備19-20
• 2.5.3 PSES-HUS質(zhì)粒轉化擴增20
• 2.5.4 PSES-HUS質(zhì)粒提取20
• 2.5.5 PSES-HUS質(zhì)粒酶切膠回收20-21
• 2.5.6 連接21
• 2.5.7 轉化21
• 2.5.8 重組質(zhì)粒驗證21-22
• 2.6 腺病毒質(zhì)粒同源重組22-23
• 2.6.1 BJ5183感受態(tài)制作22
• 2.6.2 穿梭質(zhì)粒線性化22-23
• 2.6.3 同源重組及鑒定23
• 2.7 腺病毒包裝23-24
• 2.8 重組腺病毒鑒定及滴度檢測24-26
• 2.8.1 PPARγmRNA水平鑒定24
• 2.8.2 PPARγ 蛋白水平鑒定24-25
• 2.8.3 滴度檢測25-26
• 3 結果26-30
• 3.1 PPARγsiRNA鑒定26-27
• 3.2 重組穿梭質(zhì)粒鑒定27
• 3.3 同源重組質(zhì)粒鑒定27-28
• 3.4 病毒包裝28-29
• 3.5 重組病毒鑒定29-30
• 3.6 滴度測定30
• 討論30-33
• 結論33-34
• 參考文獻34-38
• 文獻綜述38-47
• 參考文獻43-47
• 致謝47-48
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文目錄48

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