本文關(guān)鍵詞：外周血間充質(zhì)干細(xì)胞移植大鼠脊髓損傷的體內(nèi)分化與神經(jīng)功能結(jié)構(gòu)保護(hù)作用研究

  更多相關(guān)文章： 脊髓損傷 細(xì)胞移植 外周血 間充質(zhì)干細(xì)胞 大鼠

【摘要】：目的:研究外周血來源間充質(zhì)干細(xì)胞(peripheral blood-derived mesenchymal stem cells,PB-MSCs)原位移植大鼠脊髓損傷后的體內(nèi)分化及其對(duì)神經(jīng)功能結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用,以評(píng)價(jià)PB-MSCs作為間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)替代資源用于治療脊髓損傷的應(yīng)用價(jià)值。方法:1取8周齡健康SD大鼠,按每日100μg/kg劑量1次腹腔注射粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)連續(xù)動(dòng)員5天,之后取外周血約5~8 ml,密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PB-MNCs),采用貼壁培養(yǎng)法得到成纖維樣集落生長(zhǎng)細(xì)胞,取P2代應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法(immunocytochemistry staining,IC)鑒定其表型。2取P2代PB-MSCs經(jīng)PKH26熒光染料標(biāo)記后繼續(xù)培養(yǎng)至P3代移植備用。3健康成年SD大鼠66只,撞擊法制備大鼠脊髓損傷動(dòng)物模型,制模后隨機(jī)分為模型組(N=15)、PB-MSCs移植組(N=21)和PBS組(N=15)。PB-MSCs移植組在制模成功30 min后用微量注射器將10μl PB-MSCs懸液(2×104個(gè)/μl)緩慢注入到距脊髓損傷區(qū)頭、尾側(cè)各1.0 mm,距中線0.5 mm脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi),PBS組注射等量PBS作為對(duì)照。另取15只SD大鼠僅咬除椎板,不損傷脊髓作為假手術(shù)組。4術(shù)后所有大鼠每周采用Basso,Beattie,Bresnaham(BBB)行為功能評(píng)定表和Ravlin斜板實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠進(jìn)行行為及肢體運(yùn)動(dòng)功能檢查,評(píng)定損傷后大鼠運(yùn)動(dòng)功能的變化情況。5術(shù)后2周、4周、8周取損傷區(qū)脊髓組織石蠟切片HE染色觀察組織病理學(xué)變化;免疫組織化學(xué)染色法觀察脊髓組織膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)、神經(jīng)絲蛋白-200(neurofilament-200,NF-200)和微管相關(guān)蛋白-2(microtubule associated protein-2,MAP-2)的表達(dá),用以研究神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成、髓鞘保護(hù)及軸突再生情況。6PB-MSCs移植組應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)PKH26陽性的PB-MSCs在損傷段脊髓組織的定植、存活,并用雙熒光技術(shù)分別檢測(cè)PKH26+GFAP+、PKH26+MBP+和PKH26+Neu N+雙陽性細(xì)胞,以研究PB-MSCs向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞的分化情況。結(jié)果:1PB-MNCs原代培養(yǎng)至9天可見明顯的成纖維樣細(xì)胞的集落樣生長(zhǎng),培養(yǎng)至18天左右細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度可達(dá)80%;傳代細(xì)胞貼壁能力強(qiáng),形態(tài)均一,呈梭形漩渦狀生長(zhǎng)。2FCM和免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果表明,富集的PB-MSCs高表達(dá)CD90、CD44、CD29、CD73及CD105,不表達(dá)CD45、CD11b、CD79a、CD34和HLA-DR。3術(shù)后1w及2w模型組、PBS組和PB-MSCs移植組斜板試驗(yàn)及BBB評(píng)分三組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㧐0.05),第3w起,PB-MSCs移植組斜板試驗(yàn)和BBB評(píng)分結(jié)果明顯高于同期模型組和PBS組(P㩳0.01),模型組和PBS組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P㧐0.05)。4HE染色結(jié)果顯示模型組、PBS組和PB-MSCs移植組術(shù)后2 w脊髓組織損傷區(qū)灰白質(zhì)界限不清,神經(jīng)纖維排列紊亂、壞死空洞形成,可見增生的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞;術(shù)后4 w壞死空洞較前小且少,模型組、PBS組神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生,PB-MSCs移植組增生不明顯;術(shù)后8 w模型組、PBS組神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生并聚集形成膠質(zhì)瘢痕,PB-MSCs移植組神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生較前變化不大,未見膠質(zhì)瘢痕形成。5免疫組化結(jié)果顯示PB-MSCs移植組GFAP表達(dá)低于模型組和PBS組(P㩳0.01);MBP、NF-200、MAP-2陽性表達(dá)PB-MSCs移植組高于模型組和PBS組(P㩳0.01)。6PB-MSCs移植組脊髓組織冰凍切片可觀察到移植治療后2 w、4 w及8 w時(shí)損傷區(qū)均有PB-MSCs存活,并見PKH26+GFAP+、PKH26+MBP+及PKH26+Neu N+雙熒光陽性細(xì)胞。結(jié)論:PB-MSCs移植可明顯改善SCI大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù);原位移植的PB-MSCs在大鼠體內(nèi)能定植、存活至少8周,并可向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化;同時(shí),PB-MSCs移植可降低膠質(zhì)瘢痕的形成,保護(hù)髓鞘,促進(jìn)神經(jīng)元軸突的再生。上述結(jié)果為PB-MSCs移植治療SCI提供了臨床前實(shí)驗(yàn)研究證據(jù),PB-MSCs有望成為治療SCI的理想MSCs替代資源。
【關(guān)鍵詞】：脊髓損傷 細(xì)胞移植 外周血 間充質(zhì)干細(xì)胞 大鼠
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R651.2
【目錄】：

• 中英文縮略詞對(duì)照表4-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-13
• 1.材料與方法13-22
• 2.結(jié)果22-35
• 3.討論35-37
• 4.結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-43
• 綜述 脊髓損傷治療研究進(jìn)展43-49
• 參考文獻(xiàn)47-49
• 致謝49-50
• 作者簡(jiǎn)介50

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3 編譯 于娜;早期脊髓損傷有新療法[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2009年

4 通訊員　陳亞偉　記者　徐丹鹿;我國(guó)每年脊髓損傷者數(shù)萬人[N];光明日?qǐng)?bào);2003年

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6 上海浦東 陸至順;脊髓損傷患者的心理特征[N];上海中醫(yī)藥報(bào);2013年

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8 鄭穎t，

本文編號(hào)：1049417