本文關(guān)鍵詞：膠原基雙層支架用于皮膚創(chuàng)面修復(fù)及附屬器官再生的研究

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【摘要】：膠原是細胞外基質(zhì)的重要組成部分,膠原分子中包含有促細胞黏附和生長的RGD多肽片段,表現(xiàn)出良好的細胞相容性,在組織工程皮膚領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。本文旨在以膠原為基本材料,以牛跟腱為原料利用乙酸和胃蛋白酶結(jié)合抽提的方法,改進膠原的提純工藝。實驗結(jié)果表明,當反應(yīng)溫度為4℃,乙酸溶脹時間為24h,胃蛋白酶濃度為0.1%,鹽析濃度為2.6M,鹽析時間為12h,最終膠原的純度在98%以上。通過紅外光譜,紫外光譜及氨基酸自動分析儀將所提取的蛋白質(zhì)定性為膠原；通過SDS-PAGE凝膠電泳測試出所提取的膠原蛋白分子量大于300k Da,且純度高。通過透射電子顯微鏡觀察到了膠原在溶液中的纖維狀形態(tài)。熱學性能檢測出了膠原的熱變性溫度在65℃左右。膠原的重金屬元素以及總糖含量都符合國家標準。在此基礎(chǔ)上,以自提膠原和殼聚糖為主要原料,采用風干-冷凍凍干的方法,進一步仿生模擬人體皮膚的結(jié)構(gòu)與功能,構(gòu)建了一種具有雙層結(jié)構(gòu)的皮膚再生支架：不對稱膠原抗菌雙層支架。致密層將包裹抗菌藥物磺胺嘧啶銀的明膠微球負載在膠原纖維上模擬皮膚的表皮層,起著避免細菌侵入、防止水分蒸發(fā)等作用。而多孔層由膠原-殼聚糖三維支架構(gòu)成,具有良好的孔隙結(jié)構(gòu),模擬真皮的細胞外基質(zhì),以誘導(dǎo)缺損真皮組織再生。膠原不對稱抗菌支架具有良好的力學性能,可以控制水蒸氣的蒸發(fā),對革蘭氏陰性菌和陽性菌均具有明顯的抑制作用�；前粪奏ゃy可持續(xù)緩釋72h,有效避免了直接加藥的細胞毒性。體外的成纖維細胞培養(yǎng)證明,膠原不對稱抗菌支架具有良好的細胞相容性及細胞活性。為了在表皮和真皮組織修復(fù)的同時實現(xiàn)汗腺再生,構(gòu)建了可表達表皮生長因子(EGF)和外環(huán)蛋白(EDA)的功能質(zhì)粒pDNA-EGF和pDNA-EDA,實現(xiàn)對目的蛋白EGF和EDA的持續(xù)表達。以骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)為種子細胞,制備負載BMSCs的基因活性膠原-殼聚糖支架材料。以負載BMSC的空白支架和pDNA-EGF的硅膠膜/膠原殼聚糖雙層支架(BDE)為對照組,將負載pDNA-EGF,pDNA-EDA及pDNA-EGF/EDA/MSC的實驗組BDEs植入SD大鼠的腳掌全層皮膚損傷模型中。對2W、4W和8W的組織切片HE染色分析發(fā)現(xiàn),在8W時實驗組中發(fā)現(xiàn)了類似線圈形狀的單管狀汗腺結(jié)構(gòu)。為鑒定再生類汗腺結(jié)構(gòu),對再生組織進行免疫組化(IHC)分析發(fā)現(xiàn),再生類汗腺結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)CEA、CK8和CK14陽性,表明再生類汗腺結(jié)構(gòu)具有汗腺特征。對其進行實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-qPCR)及蛋白免疫印跡(Western Blotting)測試,相對于對照組,實驗組的CEA、CK8和CK14因子蛋白及基因水平的表達都較高。
【關(guān)鍵詞】：膠原 雙層皮膚支架 抗菌 EGF EDA 基因活性 附屬器官
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：TQ427.26;R641
【目錄】：

• 致謝4-5
• 摘要5-7
• Abstracts7-12
• 第一章 引言12-33
• 1.1 皮膚組織工程12-20
• 1.1.1 皮膚的結(jié)構(gòu)與功能12-13
• 1.1.2 皮膚修復(fù)過程13-14
• 1.1.2.1 止血期14
• 1.1.2.2 炎癥期14
• 1.1.2.3 增殖期14
• 1.1.2.4 重塑期14
• 1.1.3 皮膚替代物14-18
• 1.1.3.1 創(chuàng)面敷料15
• 1.1.3.2 人工皮膚15
• 1.1.3.3 組織工程皮膚15-18
• 1.1.4 皮膚組織工程常用生物材料18-20
• 1.1.4.1 膠原18-19
• 1.1.4.2 明膠19
• 1.1.4.3 殼聚糖19
• 1.1.4.4 纖維蛋白19-20
• 1.1.4.5 其它材料20
• 1.2 皮膚附屬器官再生20-27
• 1.2.1 皮膚附屬器官介紹20
• 1.2.2 汗腺介紹20-21
• 1.2.3 汗腺再生相關(guān)細胞21-22
• 1.2.4 汗腺再生相關(guān)生長因子22-23
• 1.2.5 汗腺再生的材料體系設(shè)計23-27
• 1.2.5.1 薄膜23-25
• 1.2.5.2 微球25
• 1.2.5.3 水凝膠25-26
• 1.2.5.4 支架26-27
• 1.3 基因治療在創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用27-30
• 1.3.1 基因治療概述27-28
• 1.3.2 基因傳遞載體28-29
• 1.3.2.1 病毒載體28
• 1.3.2.2 非病毒載體28-29
• 1.3.3 基因活性支架29-30
• 1.4 課題提出30-33
• 第二章 膠原的提純與性能表征33-45
• 2.1 實驗部分34-35
• 2.1.1 實驗試劑和原料34-35
• 2.1.2 膠原的提取與提純工藝35
• 2.2 膠原的理化性能表征35-38
• 2.2.1 紅外光譜測試35
• 2.2.2 紫外光譜測試35-36
• 2.2.3 氨基酸含量分析(純度)36
• 2.2.4 羥脯氨酸含量分析36
• 2.2.5 透射電子顯微鏡觀察36
• 2.2.6 分子量測定36-37
• 2.2.7 熱穩(wěn)定性分析37
• 2.2.8 總糖含量測定37-38
• 2.2.9 微量元素分析38
• 2.2.10 統(tǒng)計學分析38
• 2.3 結(jié)果與討論38-44
• 2.3.1 紅外光譜測試38-39
• 2.3.2 紫外光譜測試39-40
• 2.3.3 氨基酸含量分析(純度)40
• 2.3.4 羥脯氨酸含量分析40-41
• 2.3.5 透射電子顯微鏡觀察41-42
• 2.3.6 分子量測定42
• 2.3.7 熱穩(wěn)定性分析42-43
• 2.3.8 總糖含量測定43-44
• 2.3.9 膠原的重金屬元素含量測定44
• 2.6 本章小結(jié)44-45
• 第三章 膠原不對稱抗菌雙層支架的制備及性能研究45-61
• 3.1 實驗部分45-50
• 3.1.1 實驗原料和試劑45-46
• 3.1.2 AgSD-明膠微球的制備46
• 3.1.3 AgSD-明膠微球的表征46-47
• 3.1.3.1 AgSD-明膠微球的表面形態(tài)及粒徑46-47
• 3.1.3.2 AgSD-明膠微球載藥量和包封率的測定47
• 3.1.3.3 AgSD-明膠微球的體外釋藥性能47
• 3.1.4 包裹明膠微球膠原雙層支架的制備47-48
• 3.1.5 膠原不對稱抗菌雙層支架的形貌表征48
• 3.1.6 膠原不對稱抗菌雙層支架的物理性能48
• 3.1.6.1 膠原不對稱抗菌雙層支架的力學性能48
• 3.1.6.2 膠原不對稱抗菌雙層支架的透濕性能48
• 3.1.6.3 膠原不對稱抗菌雙層支架的吸水率測定48
• 3.1.7 抑菌圈實驗48-49
• 3.1.8 膠原不對稱抗菌雙層支架的生物相容性評價49-50
• 3.1.8.1 材料及儀器的滅菌處理49
• 3.1.8.2 不同載藥量膠原抗菌雙層支架的細胞毒性評價49
• 3.1.8.3 膠原抗菌雙層支架的細胞相容性評價49-50
• 3.1.9 統(tǒng)計學分析50
• 3.2 結(jié)果與討論50-59
• 3.2.1 空白和載藥明膠微球的形貌表征50-51
• 3.2.2 AgSD-明膠微球載藥量和包封率的測定51
• 3.2.3 AgSD-明膠微球的體外釋藥性能51-53
• 3.2.5 膠原不對稱抗菌雙層支架的物理性能53-56
• 3.2.5.1 膠原不對稱抗菌雙層支架的力學性能53-54
• 3.2.5.2 膠原不對稱抗菌雙層支架的透濕性能54-55
• 3.2.5.3 膠原不對稱抗菌雙層支架的吸水率測定55-56
• 3.2.6 抑菌圈實驗56-57
• 3.2.7 膠原不對稱抗菌雙層支架的生物相容性評價57-59
• 3.2.7.1 不同載藥量膠原抗菌雙層支架的細胞毒性評價57-58
• 3.2.7.2 膠原抗菌雙層支架的細胞相容性評價58-59
• 3.2.7.3 胞形態(tài)59
• 3.3 本章小結(jié)59-61
• 第四章 基因活性膠原基雙層支架誘導(dǎo)汗腺再生的體內(nèi)評價實驗61-80
• 4.1 實驗部分62-70
• 4.1.1 實驗原料和試劑62-63
• 4.1.2 膠原殼聚糖支架的制備63-64
• 4.1.3 基因復(fù)合納米粒子的制備64
• 4.1.4 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的提取及培養(yǎng)64
• 4.1.5 基因活性膠原雙層支架的制備64-65
• 4.1.6 動物實驗?zāi)Ｐ?/span>65
• 4.1.7 大體觀察與統(tǒng)計結(jié)果分析65
• 4.1.8 組織學觀察65-66
• 4.1.9 汗腺結(jié)構(gòu)鑒定66
• 4.1.10 再生組織PCR分析66-68
• 4.1.11 再生組織Western Blotting分析68-70
• 4.1.12 統(tǒng)計學分析70
• 4.2 結(jié)果與討論70-78
• 4.2.1 膠原基因活性支架形貌表征70-71
• 4.2.2 負載細胞的膠原基因活性支架分析71
• 4.2.3 動物實驗?zāi)Ｐ?/span>71-72
• 4.2.4 傷口修復(fù)大體觀察72-73
• 4.2.5 再生汗腺組織學HE染色73-74
• 4.2.6 再生汗腺組織免疫組化分析74-76
• 4.2.7 再生汗腺組織Western Blotting分析76-78
• 4.3 本章小結(jié)78-80
• 全文結(jié)論80-81
• 不足與展望81-82
• 參考文獻82-90
• 作者簡介90

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本文編號：1038622