本文關(guān)鍵詞：膠原基雙層支架用于皮膚創(chuàng)面修復(fù)及附屬器官再生的研究

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【摘要】：膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分,膠原分子中包含有促細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)的RGD多肽片段,表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性,在組織工程皮膚領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。本文旨在以膠原為基本材料,以牛跟腱為原料利用乙酸和胃蛋白酶結(jié)合抽提的方法,改進(jìn)膠原的提純工藝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)反應(yīng)溫度為4℃,乙酸溶脹時(shí)間為24h,胃蛋白酶濃度為0.1%,鹽析濃度為2.6M,鹽析時(shí)間為12h,最終膠原的純度在98%以上。通過紅外光譜,紫外光譜及氨基酸自動(dòng)分析儀將所提取的蛋白質(zhì)定性為膠原；通過SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)試出所提取的膠原蛋白分子量大于300k Da,且純度高。通過透射電子顯微鏡觀察到了膠原在溶液中的纖維狀形態(tài)。熱學(xué)性能檢測(cè)出了膠原的熱變性溫度在65℃左右。膠原的重金屬元素以及總糖含量都符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。在此基礎(chǔ)上,以自提膠原和殼聚糖為主要原料,采用風(fēng)干-冷凍凍干的方法,進(jìn)一步仿生模擬人體皮膚的結(jié)構(gòu)與功能,構(gòu)建了一種具有雙層結(jié)構(gòu)的皮膚再生支架：不對(duì)稱膠原抗菌雙層支架。致密層將包裹抗菌藥物磺胺嘧啶銀的明膠微球負(fù)載在膠原纖維上模擬皮膚的表皮層,起著避免細(xì)菌侵入、防止水分蒸發(fā)等作用。而多孔層由膠原-殼聚糖三維支架構(gòu)成,具有良好的孔隙結(jié)構(gòu),模擬真皮的細(xì)胞外基質(zhì),以誘導(dǎo)缺損真皮組織再生。膠原不對(duì)稱抗菌支架具有良好的力學(xué)性能,可以控制水蒸氣的蒸發(fā),對(duì)革蘭氏陰性菌和陽性菌均具有明顯的抑制作用。磺胺嘧啶銀可持續(xù)緩釋72h,有效避免了直接加藥的細(xì)胞毒性。體外的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)證明,膠原不對(duì)稱抗菌支架具有良好的細(xì)胞相容性及細(xì)胞活性。為了在表皮和真皮組織修復(fù)的同時(shí)實(shí)現(xiàn)汗腺再生,構(gòu)建了可表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和外環(huán)蛋白(EDA)的功能質(zhì)粒pDNA-EGF和pDNA-EDA,實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白EGF和EDA的持續(xù)表達(dá)。以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)為種子細(xì)胞,制備負(fù)載BMSCs的基因活性膠原-殼聚糖支架材料。以負(fù)載BMSC的空白支架和pDNA-EGF的硅膠膜/膠原殼聚糖雙層支架(BDE)為對(duì)照組,將負(fù)載pDNA-EGF,pDNA-EDA及pDNA-EGF/EDA/MSC的實(shí)驗(yàn)組BDEs植入SD大鼠的腳掌全層皮膚損傷模型中。對(duì)2W、4W和8W的組織切片HE染色分析發(fā)現(xiàn),在8W時(shí)實(shí)驗(yàn)組中發(fā)現(xiàn)了類似線圈形狀的單管狀汗腺結(jié)構(gòu)。為鑒定再生類汗腺結(jié)構(gòu),對(duì)再生組織進(jìn)行免疫組化(IHC)分析發(fā)現(xiàn),再生類汗腺結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)CEA、CK8和CK14陽性,表明再生類汗腺結(jié)構(gòu)具有汗腺特征。對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)及蛋白免疫印跡(Western Blotting)測(cè)試,相對(duì)于對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組的CEA、CK8和CK14因子蛋白及基因水平的表達(dá)都較高。
【關(guān)鍵詞】：膠原 雙層皮膚支架 抗菌 EGF EDA 基因活性 附屬器官
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：TQ427.26;R641
【目錄】：

• 致謝4-5
• 摘要5-7
• Abstracts7-12
• 第一章 引言12-33
• 1.1 皮膚組織工程12-20
• 1.1.1 皮膚的結(jié)構(gòu)與功能12-13
• 1.1.2 皮膚修復(fù)過程13-14
• 1.1.2.1 止血期14
• 1.1.2.2 炎癥期14
• 1.1.2.3 增殖期14
• 1.1.2.4 重塑期14
• 1.1.3 皮膚替代物14-18
• 1.1.3.1 創(chuàng)面敷料15
• 1.1.3.2 人工皮膚15
• 1.1.3.3 組織工程皮膚15-18
• 1.1.4 皮膚組織工程常用生物材料18-20
• 1.1.4.1 膠原18-19
• 1.1.4.2 明膠19
• 1.1.4.3 殼聚糖19
• 1.1.4.4 纖維蛋白19-20
• 1.1.4.5 其它材料20
• 1.2 皮膚附屬器官再生20-27
• 1.2.1 皮膚附屬器官介紹20
• 1.2.2 汗腺介紹20-21
• 1.2.3 汗腺再生相關(guān)細(xì)胞21-22
• 1.2.4 汗腺再生相關(guān)生長(zhǎng)因子22-23
• 1.2.5 汗腺再生的材料體系設(shè)計(jì)23-27
• 1.2.5.1 薄膜23-25
• 1.2.5.2 微球25
• 1.2.5.3 水凝膠25-26
• 1.2.5.4 支架26-27
• 1.3 基因治療在創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用27-30
• 1.3.1 基因治療概述27-28
• 1.3.2 基因傳遞載體28-29
• 1.3.2.1 病毒載體28
• 1.3.2.2 非病毒載體28-29
• 1.3.3 基因活性支架29-30
• 1.4 課題提出30-33
• 第二章 膠原的提純與性能表征33-45
• 2.1 實(shí)驗(yàn)部分34-35
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和原料34-35
• 2.1.2 膠原的提取與提純工藝35
• 2.2 膠原的理化性能表征35-38
• 2.2.1 紅外光譜測(cè)試35
• 2.2.2 紫外光譜測(cè)試35-36
• 2.2.3 氨基酸含量分析(純度)36
• 2.2.4 羥脯氨酸含量分析36
• 2.2.5 透射電子顯微鏡觀察36
• 2.2.6 分子量測(cè)定36-37
• 2.2.7 熱穩(wěn)定性分析37
• 2.2.8 總糖含量測(cè)定37-38
• 2.2.9 微量元素分析38
• 2.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析38
• 2.3 結(jié)果與討論38-44
• 2.3.1 紅外光譜測(cè)試38-39
• 2.3.2 紫外光譜測(cè)試39-40
• 2.3.3 氨基酸含量分析(純度)40
• 2.3.4 羥脯氨酸含量分析40-41
• 2.3.5 透射電子顯微鏡觀察41-42
• 2.3.6 分子量測(cè)定42
• 2.3.7 熱穩(wěn)定性分析42-43
• 2.3.8 總糖含量測(cè)定43-44
• 2.3.9 膠原的重金屬元素含量測(cè)定44
• 2.6 本章小結(jié)44-45
• 第三章 膠原不對(duì)稱抗菌雙層支架的制備及性能研究45-61
• 3.1 實(shí)驗(yàn)部分45-50
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)原料和試劑45-46
• 3.1.2 AgSD-明膠微球的制備46
• 3.1.3 AgSD-明膠微球的表征46-47
• 3.1.3.1 AgSD-明膠微球的表面形態(tài)及粒徑46-47
• 3.1.3.2 AgSD-明膠微球載藥量和包封率的測(cè)定47
• 3.1.3.3 AgSD-明膠微球的體外釋藥性能47
• 3.1.4 包裹明膠微球膠原雙層支架的制備47-48
• 3.1.5 膠原不對(duì)稱抗菌雙層支架的形貌表征48
• 3.1.6 膠原不對(duì)稱抗菌雙層支架的物理性能48
• 3.1.6.1 膠原不對(duì)稱抗菌雙層支架的力學(xué)性能48
• 3.1.6.2 膠原不對(duì)稱抗菌雙層支架的透濕性能48
• 3.1.6.3 膠原不對(duì)稱抗菌雙層支架的吸水率測(cè)定48
• 3.1.7 抑菌圈實(shí)驗(yàn)48-49
• 3.1.8 膠原不對(duì)稱抗菌雙層支架的生物相容性評(píng)價(jià)49-50
• 3.1.8.1 材料及儀器的滅菌處理49
• 3.1.8.2 不同載藥量膠原抗菌雙層支架的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)49
• 3.1.8.3 膠原抗菌雙層支架的細(xì)胞相容性評(píng)價(jià)49-50
• 3.1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析50
• 3.2 結(jié)果與討論50-59
• 3.2.1 空白和載藥明膠微球的形貌表征50-51
• 3.2.2 AgSD-明膠微球載藥量和包封率的測(cè)定51
• 3.2.3 AgSD-明膠微球的體外釋藥性能51-53
• 3.2.5 膠原不對(duì)稱抗菌雙層支架的物理性能53-56
• 3.2.5.1 膠原不對(duì)稱抗菌雙層支架的力學(xué)性能53-54
• 3.2.5.2 膠原不對(duì)稱抗菌雙層支架的透濕性能54-55
• 3.2.5.3 膠原不對(duì)稱抗菌雙層支架的吸水率測(cè)定55-56
• 3.2.6 抑菌圈實(shí)驗(yàn)56-57
• 3.2.7 膠原不對(duì)稱抗菌雙層支架的生物相容性評(píng)價(jià)57-59
• 3.2.7.1 不同載藥量膠原抗菌雙層支架的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)57-58
• 3.2.7.2 膠原抗菌雙層支架的細(xì)胞相容性評(píng)價(jià)58-59
• 3.2.7.3 胞形態(tài)59
• 3.3 本章小結(jié)59-61
• 第四章 基因活性膠原基雙層支架誘導(dǎo)汗腺再生的體內(nèi)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)61-80
• 4.1 實(shí)驗(yàn)部分62-70
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)原料和試劑62-63
• 4.1.2 膠原殼聚糖支架的制備63-64
• 4.1.3 基因復(fù)合納米粒子的制備64
• 4.1.4 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取及培養(yǎng)64
• 4.1.5 基因活性膠原雙層支架的制備64-65
• 4.1.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/span>65
• 4.1.7 大體觀察與統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析65
• 4.1.8 組織學(xué)觀察65-66
• 4.1.9 汗腺結(jié)構(gòu)鑒定66
• 4.1.10 再生組織PCR分析66-68
• 4.1.11 再生組織Western Blotting分析68-70
• 4.1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析70
• 4.2 結(jié)果與討論70-78
• 4.2.1 膠原基因活性支架形貌表征70-71
• 4.2.2 負(fù)載細(xì)胞的膠原基因活性支架分析71
• 4.2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/span>71-72
• 4.2.4 傷口修復(fù)大體觀察72-73
• 4.2.5 再生汗腺組織學(xué)HE染色73-74
• 4.2.6 再生汗腺組織免疫組化分析74-76
• 4.2.7 再生汗腺組織Western Blotting分析76-78
• 4.3 本章小結(jié)78-80
• 全文結(jié)論80-81
• 不足與展望81-82
• 參考文獻(xiàn)82-90
• 作者簡(jiǎn)介90

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