本文關(guān)鍵詞：重組腺病毒介導(dǎo)Sox9表達(dá)對(duì)人椎間盤(pán)細(xì)胞退變的影響

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【摘要】：研究背景腰背部疼痛是當(dāng)今困擾人類的最常見(jiàn)骨科疾病之一,其原因有椎間盤(pán)退行性變、腰背部肌肉勞損等,其中有約4/5的病人是以下腰痛為主要病癥來(lái)醫(yī)院就診,下腰痛的最主要原因是椎間盤(pán)的退行性變。學(xué)者發(fā)現(xiàn),椎間盤(pán)的退行性變與組織形態(tài)學(xué)、生物力學(xué)、遺傳學(xué)、基因分子學(xué)等有關(guān)[1]。椎間盤(pán)是脊柱的重要組成部分,其在維持脊柱生理曲度及穩(wěn)定性方面起著重要的作用。其主要有周圍的纖維化組織,中間的髓核組織,以及上下的軟骨終板組成,為脊柱應(yīng)力緩沖的主要結(jié)構(gòu),起著彈性墊作用。椎間盤(pán)退變,在外力的作用下,其纖維環(huán)組織退變并破裂,中間的髓核組織通過(guò)破裂纖維環(huán)的缺口處脫出或者突出后方的椎管內(nèi),壓迫相應(yīng)的脊髓和神經(jīng),脊髓和神經(jīng)長(zhǎng)期受壓,發(fā)生水腫、炎癥,進(jìn)而引起腰背痛、下肢無(wú)力、疼麻等為主、甚至截癱的臨床癥狀。陳立等人對(duì)椎間盤(pán)退行性變的研究表明,在正常的生物應(yīng)力作用下,軟骨終板上的蛋白聚糖合成和降解二者處于動(dòng)態(tài)平衡,而在異常應(yīng)力的作用下,軟骨終板的蛋白聚糖出現(xiàn)合成減少、但是降解增加,打破了這種動(dòng)態(tài)平衡,從而改變了椎間盤(pán)的原有組織結(jié)構(gòu)成分,最終導(dǎo)致了椎間盤(pán)的退行性變。成年后的椎間盤(pán)細(xì)胞及組織失去了血液的營(yíng)養(yǎng)供給,其營(yíng)養(yǎng)主要依靠終板和纖維環(huán)的擴(kuò)散方式來(lái)獲取,而隨著年齡的增加,椎體的終板逐漸出現(xiàn)鈣化甚至硬化,致使椎間盤(pán)的營(yíng)養(yǎng)途徑被切斷,而導(dǎo)致椎間盤(pán)的退行性變。目前相關(guān)學(xué)者的主要研究方向集中在椎間盤(pán)退行性變的臨床治療方法,目前針對(duì)椎間盤(pán)退行性變的主要方案相關(guān)的保守治療以及不同方式的手術(shù)治療,保守治療包括相應(yīng)的藥物治療、理療及臥床休息等,僅能暫時(shí)起到緩解或部分緩解臨床癥狀的效果,在身體勞累或者其他應(yīng)力改變的情況下,上述癥狀會(huì)再次出現(xiàn),甚至加重。而隨著20世紀(jì)40年代,Jaslow和Clowoud等人將后路腰椎椎間融合術(shù)(Postive Lumbar Interbody Fusion PLIF)[2]的方法引入臨床應(yīng)用,臨床上開(kāi)始應(yīng)用減壓融合術(shù)來(lái)治療椎間盤(pán)退行性變,其可明顯的改善臨床癥狀,但改變了脊柱本身的應(yīng)力結(jié)構(gòu),對(duì)鄰近階段以及整個(gè)脊柱的生物力學(xué)的影響,暫時(shí)并不十分確切,上述方法雖能緩解或者部分緩解椎間盤(pán)退行性變引起的臨床癥狀,但均無(wú)法從根本上來(lái)治療椎間盤(pán)的退行性變。如何早期發(fā)現(xiàn)、并徹底治療椎間盤(pán)的退行性變逐漸成了學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,學(xué)者們開(kāi)始著手對(duì)椎間盤(pán)退行性變的機(jī)制上進(jìn)行基礎(chǔ)研究,并有部分學(xué)者開(kāi)始使用動(dòng)物模型來(lái)模擬椎間盤(pán)退行性變進(jìn)行基因治療[3-4],并獲得了可靠的療效。目前研究的基因主要包括椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)相關(guān)基因(COLl Al基因、Sox9基因、COL9A2、COL9A3基因、COLll A2基因、PG基因、CILP基因等)、骨質(zhì)疏松相關(guān)基因(維生素D受體基因、雌激素受體基因)、椎間盤(pán)代謝相關(guān)基因(MMP-1、MMP3基因、TIMP-1、COX-2基因、TIMP-1和COX-2基因、THBS-2基因、ADH基因等)、細(xì)胞因子相關(guān)基因(炎癥相關(guān)基因、生長(zhǎng)因子類基因等)以及信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)基因(GTP環(huán)化水解酶(GCHl)等)。而在這其中Sox9基因因其獨(dú)特的生物學(xué)作用成為研究的熱點(diǎn)。Sox9基因在Sox基因家族中占據(jù)著重要的地位,它主要調(diào)控著人以及脊椎動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育,在軟骨生成修復(fù)和決定性別方面起著決定作用[5]。1994年,Foster[6]等運(yùn)用熒光原位雜交等技術(shù),在染色體的17q24位上發(fā)現(xiàn)人類Sox9基因。Wagner[7]等通過(guò)快速擴(kuò)增cDNA末端結(jié)合人胚胎腦的cDNA文庫(kù)篩選的方法,成功分離和克隆了人類Sox9基因。隨著分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展以及對(duì)椎間盤(pán)退行性變機(jī)制研究的不斷深入,從越來(lái)越多的相關(guān)試驗(yàn)證據(jù)中,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)椎間盤(pán)的發(fā)育、成熟到退變的整個(gè)變化過(guò)程均有Sox9基因的參與。如今,學(xué)者們對(duì)Sox9基因可促進(jìn)II型膠原蛋白、蛋白聚糖的生成以及細(xì)胞增殖的作用已十分明確,并對(duì)相關(guān)調(diào)控機(jī)制也有了很多了解。Gruber等[8]收集了37例(年齡從15-76歲)人類椎間盤(pán)纖維環(huán)做Sox9基因的免疫組化染色,發(fā)現(xiàn)在年輕人的纖維環(huán)細(xì)胞中甚至髓核細(xì)胞中Sox9基因呈均勻染色,隨著年齡的增加以及椎間盤(pán)的退行性變,纖維環(huán)細(xì)胞中的Sox9基因染色逐漸的減少甚至消失。已有學(xué)者研究證實(shí),在關(guān)節(jié)炎等相關(guān)疾病中高度表達(dá)的致炎因子可以明顯的抑制Sox9基因的生物學(xué)作用,從而減弱了病變軟骨的再生和修復(fù)能力,而在椎間盤(pán)退行性變過(guò)程中,Sox9基因[9]的生物學(xué)作用是否也被抑制,從而使得退變的椎間盤(pán)難以自身修復(fù),在椎間盤(pán)退行性變的過(guò)程中是否存在Sox9基因的點(diǎn)突變、調(diào)控方面的缺陷及為何會(huì)出現(xiàn)Sox9基因的表達(dá)降低等問(wèn)題有待進(jìn)一步地研究。故構(gòu)建安全、可靠、有效的Sox9基因重組腺病毒載體[10-11]對(duì)相關(guān)的研究十分必要,以往學(xué)者使用較多的Ad Easy系統(tǒng)進(jìn)行腺病毒載體的構(gòu)建,其在保存和產(chǎn)生效率方面均存在缺陷。而AdMax系統(tǒng)腺病毒包裝系統(tǒng)具有操作性簡(jiǎn)便、病毒重組效率高、基因突變率低、病毒生產(chǎn)率高等優(yōu)勢(shì),選用其構(gòu)建相關(guān)Sox9基因的腺病毒載體,可為進(jìn)一步研究Sox9基因在椎間盤(pán)退行性變中的作用及相關(guān)機(jī)制提供穩(wěn)定可靠的腺病毒載體。應(yīng)用構(gòu)建的Sox9腺病毒載體感染所培養(yǎng)的人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞,并觀察該細(xì)胞中II型膠原蛋白及蛋白聚糖的含量發(fā)生的變化,以徹底了解該基因?qū)θ俗甸g盤(pán)的生物學(xué)效應(yīng)。目的應(yīng)用AdMax包裝系統(tǒng)構(gòu)建Sox9基因的腺病毒載體,并對(duì)其進(jìn)行鑒定,為Sox9基因的相關(guān)研究提供可靠地腺病毒載體。將含Sox9基因的該腺病毒載體感染人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞,了解其對(duì)人椎間盤(pán)細(xì)胞的生物學(xué)作用。方法1.腺病毒載體建立法運(yùn)用PCR方法對(duì)Sox9基因進(jìn)行擴(kuò)增,將擴(kuò)增后的基因篩選后重組入線性化的p AV-MCMV-GFP-3FLAG,然后轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細(xì)胞,得到轉(zhuǎn)化子;運(yùn)用菌落PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定,鑒定完畢后,所得到的轉(zhuǎn)化子通過(guò)AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞,并在其中進(jìn)行包裝成熟、擴(kuò)增。2.腺病毒載體的檢測(cè)方法應(yīng)用Western Blot檢測(cè)法對(duì)Sox9基因重組腺病毒進(jìn)行檢測(cè),把建立的腺病毒載體的病毒DNA進(jìn)行PCR鑒定、免疫熒光組化測(cè)定以及基因測(cè)序,并進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。3.培養(yǎng)人退變椎間盤(pán)髓核細(xì)胞并感染鑒定好的Sox9基因載體,并通過(guò)免疫熒光染色了解退變椎間盤(pán)髓核細(xì)胞的中II型膠原蛋白的變化。結(jié)果在以Sox9基因?yàn)槟０錚CR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物大小:1565bp,并經(jīng)測(cè)序結(jié)果與Sox9基因?qū)Ρ确治?表明陽(yáng)性克隆與Sox9基因一致,說(shuō)明Sox9基因擴(kuò)增成功。把獲得的病毒DNA進(jìn)行PCR鑒定,得到1565bp片段,說(shuō)明Sox9基因片段已經(jīng)重組進(jìn)入腺病毒。腺病毒的滴度為:2.3×1011PFU/ml。通過(guò)Western Blot檢測(cè),在72-95KDa之間可以看到陽(yáng)性條帶,其與Sox9-GFP-Flag的融合蛋白(56KDa+28KDa+2KDa=86KDa)的大小吻合。在感染人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞后熒光染色后發(fā)現(xiàn)較對(duì)照組其II型膠原的含量增加。結(jié)論Sox9基因增加了人退變椎間盤(pán)細(xì)胞的II型膠原蛋白的增加。
【關(guān)鍵詞】：Sox9基因 腺病毒載體 AdMax系統(tǒng) AdEasy系統(tǒng) 椎間盤(pán)退行性變 II型膠原蛋白
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R681.5
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-13
• 中英文縮寫(xiě)詞對(duì)照表13-14
• 引言14-16
• 實(shí)驗(yàn)材料儀器16-18
• 方法18-26
• 結(jié)果26-35
• 討論35-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-43
• 綜述 SOX9 基因與椎間盤(pán)退行性變研究進(jìn)展43-54
• 參考文獻(xiàn)51-54
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果54-55
• 致謝55

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