本文關(guān)鍵詞：灌注式培養(yǎng)復(fù)方殼多糖組織工程皮膚流速及營(yíng)養(yǎng)條件的初步研究

  更多相關(guān)文章： 組織工程皮膚 灌注 流速 營(yíng)養(yǎng)濃度 增殖 凋亡

【摘要】：皮膚是人體最重要的防御屏障,但因其直接與外界環(huán)境接觸,也最易受到各種損傷和疾病的傷害從而導(dǎo)致皮膚缺損,除了常規(guī)療法外,可以使用組織工程皮膚來(lái)修復(fù)。復(fù)方殼多糖組織工程皮膚作為一個(gè)較理想的三維模型,一直采用傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)方式,雖然技術(shù)已較為成熟,仍面臨培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)、工作量大、偶有污染等缺點(diǎn)。而新興的灌注式培養(yǎng)這一動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的方法可以避免諸多靜態(tài)培養(yǎng)無(wú)法避免的問(wèn)題。目前已研制的灌注式培養(yǎng)模式有五層重疊式、MINUTH灌注式培養(yǎng)等方法,但是對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞有較強(qiáng)的針對(duì)性,應(yīng)用相對(duì)局限,且培養(yǎng)出的細(xì)胞與靜態(tài)培養(yǎng)相比活力比較接近,優(yōu)勢(shì)并不是十分突出。我們?cè)诒敬螌?shí)驗(yàn)中使用的灌注設(shè)備是我們自行研制的疊層式生物反應(yīng)器,在進(jìn)一步改進(jìn)、優(yōu)化后以求能達(dá)到更好的細(xì)胞培養(yǎng)效果。通過(guò)初步采用灌注式培養(yǎng)方法培養(yǎng)了組織工程皮膚,采用不同灌注流速比較組織工程真皮的細(xì)胞增殖情況,研究不同營(yíng)養(yǎng)濃度對(duì)組織工程皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞增殖凋亡的影響,為進(jìn)一步改善灌注培養(yǎng)條件提供更多依據(jù),為灌注式培養(yǎng)在組織工程皮膚方面的深入應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。目的:1、簡(jiǎn)要分析、比較目前我們采用的灌注式培養(yǎng)器低流速與高流速流場(chǎng)的均勻性與剪切力。2、研究不同灌注流速對(duì)組織工程皮膚真皮細(xì)胞增殖的影響,初步摸索出較適合組織工程真皮動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的灌注速度。3、比較不同營(yíng)養(yǎng)濃度對(duì)組織工程雙層皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞增殖凋亡的影響,摸索較適宜細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)濃度條件。方法:1、利用計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)(Computational Fluid Dynamics,CFD),采用兩相流模型進(jìn)行三維流場(chǎng)計(jì)算模擬,進(jìn)行流場(chǎng)均勻性與剪切力的分析。2、酶消化分離青年男性包皮標(biāo)本獲得成纖維細(xì)胞,并進(jìn)行培養(yǎng)、傳代,使用第2代成纖維細(xì)胞構(gòu)建復(fù)方殼多糖組織工程真皮。在低流量(80ml/min)及高流量(800ml/min)的灌注速度條件下培養(yǎng)復(fù)方殼多糖組織工程真皮,用MTT法檢測(cè)兩個(gè)流速狀態(tài)下真皮細(xì)胞的存活和增殖情況,并做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。3、使用第2代角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建含表真皮的復(fù)方殼多糖組織工程雙層皮膚。將其分別置于含40%及80%低糖DMEM的培養(yǎng)基下進(jìn)行灌注式培養(yǎng),分別于5天及10天取材,進(jìn)行HE染色觀察細(xì)胞形態(tài),利用ki67檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡,計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:1、我們研制的灌注設(shè)備結(jié)構(gòu)在流量較低時(shí)(如80ml/min時(shí)),營(yíng)養(yǎng)液速度、動(dòng)靜壓、流場(chǎng)漩渦度、速度梯度、流場(chǎng)矢量等指標(biāo)能夠保證很好的均勻性。當(dāng)流量增大時(shí),全場(chǎng)流速增大,動(dòng)靜壓也有不同程度增高,流場(chǎng)失去均勻性特性。2、MTT的結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),低流速灌注條件下組織工程真皮內(nèi)的MTT值隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加,提示真皮內(nèi)的活細(xì)胞數(shù)不斷增加,細(xì)胞處于持續(xù)增殖狀態(tài)。另外,低流速灌注培養(yǎng)下的細(xì)胞活力顯著高于靜態(tài)培養(yǎng)。而高流速灌注情況下的細(xì)胞活力較靜態(tài)培養(yǎng)差。3、低流速灌注培養(yǎng)的組織工程皮膚細(xì)胞在HE染色下形態(tài)較好,真表皮雙層結(jié)構(gòu)清晰,表明在灌注培養(yǎng)下,組織工程皮膚仍能獲得較好的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。4、免疫組化檢測(cè)ki67的結(jié)果顯示:表皮和真皮內(nèi)的ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在80%濃度的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)都顯著高于40%濃度的DMEM培養(yǎng)基(P0.05)。與80%濃度培養(yǎng)5d相比,80%濃度培養(yǎng)10d時(shí)真皮層內(nèi)ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),顯著減少(P0.05)。5、用TUNEL檢測(cè)培養(yǎng)基的濃度對(duì)雙層組織工程皮膚內(nèi)細(xì)胞凋亡的影響,經(jīng)統(tǒng)計(jì),真皮和表皮內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量表明40%濃度DMEM培養(yǎng)組顯著高于80%濃度DMEM培養(yǎng)組(P0.05)。與80%濃度DMEM培養(yǎng)5d相比,80%濃度培養(yǎng)10d的表皮層內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P0.05)。結(jié)論:灌注設(shè)備在流速較低時(shí)(80ml/min時(shí)),流場(chǎng)的各項(xiàng)流動(dòng)指標(biāo)能夠保證很好的均勻性,是合適的灌注流速,且灌注式動(dòng)態(tài)培養(yǎng)模式優(yōu)于靜態(tài)培養(yǎng),適用于組織工程皮膚的培養(yǎng)。營(yíng)養(yǎng)條件的比較上,80%培養(yǎng)基濃度優(yōu)于40%培養(yǎng)基濃度的培養(yǎng)效果。
【關(guān)鍵詞】：組織工程皮膚 灌注 流速 營(yíng)養(yǎng)濃度 增殖 凋亡
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R318.18
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-5
• 英文摘要5-8
• 中文摘要8-10
• 第一章 前言10-12
• 第二章 灌注式培養(yǎng)器低流速與高流速流場(chǎng)的均勻性與剪切力分析12-24
• 2.1 材料與方法12-15
• 2.2 結(jié)果及分析15-22
• 2.3 討論22-24
• 第三章 不同灌注流速對(duì)復(fù)方殼多糖組織工程真皮細(xì)胞增殖的影響24-32
• 3.1 材料和方法24-28
• 3.2 結(jié)果28-30
• 3.3 討論30-32
• 第四章 不同營(yíng)養(yǎng)濃度條件對(duì)灌注式培養(yǎng)的復(fù)方殼多糖組織工程皮膚內(nèi)細(xì)胞增殖、凋亡的影響32-43
• 4.1 材料與方法32-36
• 4.2 結(jié)果36-40
• 4.3 討論40-43
• 全文總結(jié)43-44
• 參考文獻(xiàn)44-47
• 文獻(xiàn)綜述 皮膚組織工程及灌注生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展47-55
• 參考文獻(xiàn)52-55
• 攻讀碩士期間發(fā)表的文章55-56
• 致謝56

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 王洋;蔡偉華;伍津津;唐輝;楊濤;唐書(shū)謙;;基于準(zhǔn)靜態(tài)平面流場(chǎng)的新型皮膚組織工程灌注式生物反應(yīng)室設(shè)計(jì)與初步模擬[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2013年07期

2 江華;周燕;譚文松;;采用灌注生物反應(yīng)器構(gòu)建的心肌組織中氧分布的數(shù)值模擬[J];醫(yī)用生物力學(xué);2009年01期

，

本文編號(hào)：989464