本文關(guān)鍵詞：體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮樣細(xì)胞

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【摘要】：目的：本課題探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Human Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells, hUC-MSCs)的分離、培養(yǎng)以及對其生物學(xué)特性的鑒定。構(gòu)建膠原-殼聚糖支架材料,同時檢測其生物學(xué)特性。利用hUC-MSCs的多向分化特性,探索由hUC-MSCs和膠原-殼聚糖支架構(gòu)建的3D環(huán)境結(jié)合氣-液培養(yǎng)的方式是否可誘導(dǎo)hUC-MSCs分化成表皮樣細(xì)胞,并構(gòu)建成表皮替代物,用于大鼠全層皮膚損傷的治療。方法：1.采用組織塊培養(yǎng)法來分離,培養(yǎng)原代hUC-MSCs。采用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)特征,采用流式細(xì)胞儀鑒定hUC-MSCs表面標(biāo)志物,采用成脂,成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)檢測hUC-MSCs的多向分化潛能。2.采用冷凍干燥、交聯(lián)的方法制備膠原-殼聚糖支架材料,將hUC-MSCs接種到膠原-殼聚糖支架材料上,以構(gòu)建富含生物活性的支架材料。一次接種細(xì)胞4h后,待細(xì)胞進(jìn)入支架中,二次將hUC-MSCs接種到活性支架表面上。在正常培養(yǎng)條件下,培養(yǎng)2d,然后培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)變?yōu)闅?液培養(yǎng),分別于氣-液培養(yǎng)7d,14d。利用免疫組化和western blotting的方法檢測氣-液培養(yǎng)7d,14d細(xì)胞角蛋白19(CK19)和外皮蛋白的表達(dá)情況。3.構(gòu)建直徑為1cm的SD大鼠全層皮膚損傷模型,分為三個不同的處理組：表皮替代物組,單純支架材料組,空白對照組,觀察不同處理組的創(chuàng)面愈合情況,并進(jìn)一步通過組織學(xué)的方法(HE染色)檢測大鼠皮膚修復(fù)情況。采用熒光染料示蹤的方法檢測移植入的細(xì)胞的去向。結(jié)果：1.組織塊培養(yǎng)法分離的hUC-MSCs的細(xì)胞形態(tài)呈長梭形,旋渦狀生長。流式細(xì)胞儀檢測顯示細(xì)胞陽性表達(dá)CD90, CD 105, CD73,陰性表達(dá)CD34, CD45, HLA-DR,和CD11α。誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞能夠向成脂細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化,說明分離的細(xì)胞具有多向分化的潛能。2.對構(gòu)建的膠原-殼聚糖支架材料的功能進(jìn)行評測,結(jié)果顯示生物材料具有100μm～200μm的孔徑,孔隙率約為90%,具有良好的溶脹率,生物可降解性和生物相容性,可用于細(xì)胞培養(yǎng)。3. hUC-MSCs接種到膠原-殼聚糖支架材料中,細(xì)胞在材料中分布均勻,活性良好,且細(xì)胞和細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)等都參與構(gòu)建生物活性海綿支架。hUC-MSCs在生物活性支架上采用氣-液培養(yǎng)的方式,hUC-MSCs向表皮樣細(xì)胞分化,western blotting和免疫組織化學(xué)的方法檢測氣-液培養(yǎng)7d,14d細(xì)胞角蛋白19和外皮蛋白的表達(dá)陽性。4.大鼠全層皮膚損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：在體外氣-液培養(yǎng)7d的細(xì)胞構(gòu)建的表皮替代物組雖然不能顯著加速大鼠創(chuàng)面的愈合速度,但是組織學(xué)檢測結(jié)果顯示hUC-MSCs可促進(jìn)表皮的再生和毛囊新生,細(xì)胞體內(nèi)示蹤實(shí)驗(yàn)證實(shí),植入創(chuàng)面的表皮替代物在植入后的21d,其表皮替代物內(nèi)的細(xì)胞仍然存活,但其發(fā)揮作用的機(jī)制尚不清楚,還有待進(jìn)一步研究。結(jié)論：體外由hUC-MSCs接種到膠原-殼聚糖支架材料中構(gòu)建的生物活性支架,聯(lián)合采用氣-液培養(yǎng)的方式,模擬皮膚表皮細(xì)胞生長的微環(huán)境,可以誘導(dǎo)hUC-MSCs向表皮樣細(xì)胞分化,并且由此構(gòu)建的表皮替代物來修復(fù)大鼠全層皮膚損傷,可促進(jìn)表皮的再生和毛囊新生。
【關(guān)鍵詞】：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 表皮樣細(xì)胞 膠原-殼聚糖支架材料 氣-液培養(yǎng) 創(chuàng)面愈合
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R641;R318.08
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-15
• 第一部分 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定15-25
• 材料和方法15-21
• 結(jié)果21-23
• 討論23-24
• 小結(jié)24-25
• 第二部分 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在膠原-殼聚糖支架材料中培養(yǎng)25-35
• 材料和方法25-29
• 結(jié)果29-33
• 討論33-34
• 小結(jié)34-35
• 第三部分 模擬皮膚微環(huán)境誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為表皮樣細(xì)胞35-47
• 材料和方法35-42
• 結(jié)果42-44
• 討論44-45
• 小結(jié)45-47
• 第四部分 表皮替代物促進(jìn)大鼠全層皮膚創(chuàng)面愈合47-52
• 材料和方法47-49
• 結(jié)果49-51
• 討論51-52
• 小結(jié)52
• 結(jié)論52-54
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 綜述59-67
• 參考文獻(xiàn)64-67
• 英文縮略詞表67-69
• 發(fā)表論文情況69-70
• 致謝70

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本文編號：980767