本文關(guān)鍵詞：膠原水凝膠誘導(dǎo)軟骨形成的分子生物學(xué)機(jī)制

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【摘要】：目的：考察膠原水凝膠體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSC)成軟骨的相關(guān)信號通路,并進(jìn)一步研究膠原水凝膠在體內(nèi)用于軟骨缺損修復(fù)的相關(guān)信號通路,用以研究膠原水凝膠成軟骨誘導(dǎo)作用的分子生物學(xué)機(jī)制。方法：體外分離和培養(yǎng)rBMSCs并復(fù)合膠原水凝膠用于構(gòu)建體外軟骨誘導(dǎo)模型,考察膠原水凝膠對rBMSCs軟骨誘導(dǎo)過程中信號通路的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)分四組：B組為單純細(xì)胞組(陰性對照組),離心方式三維培養(yǎng)的rBMSCs團(tuán)塊,未加軟骨誘導(dǎo)因子TGF-β1和膠原水凝膠；BT組為離心方式三維培養(yǎng)rBMSCs,未加膠原水凝膠,添加TGF-β1,作為生長因子組；BC組為膠原材料組,離心方式三維培養(yǎng)rBMSCs+膠原水凝膠；BTC組為陽性對照組,離心方式三維培養(yǎng)rBMSCs+膠原水凝膠,同時(shí)添加TGF-β1。每組分別培養(yǎng)14天、28天和42天,提取樣品,進(jìn)行如下檢測：1)采用DNA含量檢測各組之間的細(xì)胞增殖情況；2)蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各組的細(xì)胞形貌；calcein-AM/PI熒光染色觀察細(xì)胞存活狀況；3)鬼筆環(huán)肽/hoechst33258熒光染色觀察纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)在細(xì)胞中的分布和動(dòng)態(tài)變化情況：4)番紅0染色和DMMB試劑檢測細(xì)胞分泌軟骨特異基質(zhì)GAG的含量；5)采用定量qRT-PCR技術(shù)檢測軟骨形成過程中軟骨特異性基因(Acan,ColⅠ,ColⅡ,ColⅩ)和相關(guān)信號通路主要包括MAPK、Wnt以及Ihh-PTHrP中的關(guān)鍵基因(TβR-Ⅱ, TβR-Ⅰ, Smad2, Smad3, Smad4, Wnt-5a,Ihh和PTHrP)的表達(dá)；6)使用免疫組織化學(xué)檢測Ⅱ型膠原和Ⅰ型膠原和的分泌情況,以檢測成軟骨程度；7)通過免疫印跡Western Blot檢測相關(guān)信號通路關(guān)鍵蛋白ERK1/2、p38、N-cadherin、fibronectin等的表達(dá)情況。通過以上實(shí)驗(yàn)檢測手段,以檢測膠原水凝膠在體外成軟骨誘導(dǎo)能力以及相關(guān)分子機(jī)制。為了進(jìn)一步研究膠原水凝膠修復(fù)軟骨的分子機(jī)理,本研究基于兔關(guān)節(jié)軟骨缺損模型,考察膠原水凝膠修復(fù)軟骨缺損的相關(guān)信號通路。實(shí)驗(yàn)分組為：空白組(不植入任何細(xì)胞和膠原水凝膠),B組(單純細(xì)胞組,植入三維培養(yǎng)的BMSCs), BT組(生長因子組,植入添加TGF-β1三維培養(yǎng)的BMSCs), BC組(膠原材料組,植入三維培養(yǎng)的膠原水凝膠+BMSCs),BTC組(陽性對照組,植入添加TGF-β1三維培養(yǎng)的膠原水凝膠+BMSCs)。軟骨缺損修復(fù)4周、12周和24周后,分別取材,用于以下檢測：1)大體標(biāo)本觀察：對取出的軟骨修復(fù)部位進(jìn)行大體評分,大體檢測軟骨缺損修復(fù)情況；2)生物力學(xué)性能測試檢驗(yàn)修復(fù)區(qū)新生軟骨的力學(xué)性能；3)使用蘇木素-伊紅(HE)和Masson染色觀察修復(fù)部位的細(xì)胞形貌和細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況,考察新生軟骨情況及與周圍組織的界面;4)采用番紅O染色檢測軟骨特異基質(zhì)GAG的分泌情況；5)分子水平上采用qRT-PCR技術(shù)檢測軟骨形成過程中的軟骨特異性基因(Acan,ColⅠ,ColⅡ,ColⅨ)和主要信號通路包括TGF-β、MAPK、Wnt以及Ihh-PTHrP中涉及到的各信號分子(TβR-Ⅱ, TβR-Ⅰ, Smad2, Smad3, Smad4, Wnt-5a, Ihh和PTHrP)的表達(dá)情況；6)使用免疫組織化學(xué)檢測軟骨組織Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原的分泌情況。通過以上實(shí)驗(yàn)檢測手段,以判斷體內(nèi)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損模型修復(fù)情況以及修復(fù)過程中的相關(guān)信號通路。結(jié)果：通過體外構(gòu)建材料誘導(dǎo)軟骨模型,考察膠原水凝膠誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨形成過程中的相關(guān)信號通路。1)通過組織學(xué)(HE染色,番紅O染色,calcein-AM/PI熒光染色和鬼筆環(huán)肽/hoechst33258熒光染色)和生化檢測(DNA含量和GAG含量檢測)可知,BTC組(陽性對照組)誘導(dǎo)效果最好,BC組(材料組)的誘導(dǎo)結(jié)果優(yōu)于或相近BT組(生長因子組),說明膠原水凝膠材料具有軟骨誘導(dǎo)作用,且其誘導(dǎo)效果與生長因子接近,二者共同參與軟骨誘導(dǎo)過程。2)通過免疫組織化學(xué)染色及PCR檢測可知,BC組(材料組)的軟骨特異性基質(zhì)—蛋白聚糖和ⅡI型膠原表達(dá)優(yōu)于或相近BT組(生長因子組),說明膠原水凝膠材料具有軟骨誘導(dǎo)作用,與生長因子效果接近；相對于B組(陰性對照組)和BT組(生長因子組),BC組(材料組)Ⅰ型膠原的表達(dá)更低,說明膠原水凝膠材料更能維持軟骨表型,對于防止去分化更為有效。X型膠原未能在各個(gè)組中檢測到,說明各組成骨分化傾向輕微。3)軟骨誘導(dǎo)相關(guān)信號通路MAPK和Wnt中涉及到的各信號分子PCR結(jié)果表明,信號分子的表達(dá)在BT組(生長因子組),BC組(材料組)與BTC組(陽性對照組)表達(dá)均顯著優(yōu)于B組(陰性對照組),說明生長因子和材料均有軟骨誘導(dǎo)作用；BC組(材料組)的表達(dá)優(yōu)于或相近BT組(生長因子組),BTC組(陽性對照組)表達(dá)效果最好。4)免疫印跡Western Blot檢測ERK1/2、p38、N-cadherin、fibronectin等蛋白水平表達(dá),結(jié)果表明,BC組(材料組)p38、N-cadherin、fibronectin蛋白水平上調(diào),而ERK1/2蛋白水平下調(diào),說明膠原材料能夠通過促進(jìn)黏連蛋白N-cadherin和fibronectin的分泌和調(diào)節(jié)MAPK信號通路(ERK1/2、p38)促進(jìn)細(xì)胞聚集生長。以上結(jié)果說明膠原材料具有與生長因子相近的軟骨誘導(dǎo)作用,且可以通過調(diào)節(jié)TGF-β、MAPK、Wnt和Ihh-PTHrP信號通路誘導(dǎo)軟骨形成。體內(nèi)構(gòu)建軟骨缺損模型,通過大體標(biāo)本觀察、新生軟骨生物力學(xué)性能測試以及組織學(xué)染色(HE染色、番紅O染色和Masson染色)及組織學(xué)評分結(jié)果可知,空白組基本不修復(fù),說明該尺寸的軟骨缺損難以自我修復(fù)；BT組(生長因子組),BC組(材料組)與BTC組(陽性對照組)關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)效果均比空白組和B組更好,BC組(材料組)的修復(fù)效果優(yōu)于BT組(生長因子組)。通過免疫組化染色及PCR檢測可知,BC組(材料組)的軟骨特異性基質(zhì)蛋白聚糖和Ⅱ型膠原表達(dá)明顯優(yōu)于(生長因子組),說明材料在關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)中不可或缺,其作用比生長因子更好。相對于B組和BT組,BC組(材料組)Ⅰ型膠原的表達(dá)更低,說明膠原水凝膠材料對于維持軟骨表型,防止去分化更為有效。X型膠原未能在各個(gè)組中檢測到,說明成骨分化傾向輕微。信號通路涉及到的各信號分子PCR結(jié)果表明,信號分子的表達(dá)在BC組(材料組)與BTC組(陽性對照組)表達(dá)含量均比B組和BT組更好,說明膠原材料可以通過調(diào)節(jié)TGF-p,Wnt和Ihh-PTHrP信號通路誘導(dǎo)軟骨形成。結(jié)論：膠原水凝膠可誘導(dǎo)軟骨形成,并能有效修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨缺損；膠原水凝膠成軟骨過程中,與TGF-β信號通路、Wnt信號通路、MAPK信號通路、Ihh-PTHrP信號通路相關(guān)；結(jié)果表明在各個(gè)軟骨形成階段,在體外膠原水凝膠誘導(dǎo)軟骨與生長因子TGF-β誘導(dǎo)軟骨機(jī)制較為接近,在體內(nèi)膠原的軟骨誘導(dǎo)作用比生長因子更好,因此材料可取代生長因子的作用,通過優(yōu)化設(shè)計(jì)材料可實(shí)現(xiàn)軟骨的全面修復(fù)。
【關(guān)鍵詞】：膠原水凝膠 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 軟骨誘導(dǎo) 關(guān)節(jié)軟骨缺損
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R687;R318.08
【目錄】：

• 個(gè)人簡歷3-6
• 摘要6-10
• abstract10-15
• 前言15-20
• 參考文獻(xiàn)17-20
• 第一部分：膠原水凝膠誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨形成過程中的相關(guān)信號通路20-52
• 1、材料與方法20-33
• 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析33-45
• 3、討論45-49
• 參考文獻(xiàn)49-52
• 第二部分：膠原水凝膠在體內(nèi)成軟骨誘導(dǎo)的相關(guān)信號通路52-77
• 1、實(shí)驗(yàn)材料52
• 2、實(shí)驗(yàn)方法52-59
• 3、結(jié)果59-69
• 4、討論69-73
• 5、結(jié)論73-74
• 參考文獻(xiàn)74-77
• 附錄：主要英文縮略詞表77-78
• 綜述78-95
• 參考文獻(xiàn)87-95
• 致謝95-96
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文96

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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3 艾國平,粟永萍,閆國和,王蒙,劉曉宏,羅成基,程天民;誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞分化[J];中國臨床康復(fù);2002年18期

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7 寧志剛;楊柳;;膠原蛋白水凝膠在軟骨組織工程中的應(yīng)用[J];中國骨傷;2011年10期

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本文編號：959658