本文關(guān)鍵詞：成骨化羊ADSCs復(fù)合表面改性融合器構(gòu)建組織工程化骨的研究

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【摘要】：目的:當(dāng)今脊椎退行性疾病的發(fā)病率不斷上升。其治療方法主要包括脊柱融合和非融合技術(shù)。本研究在相關(guān)文獻(xiàn)報道基礎(chǔ)上,利用納米化β-磷酸三鈣/殼聚糖/聚己內(nèi)酯(β-TCP/CS/PCL)仿生椎間融合器和鈦金屬椎間融合器支架復(fù)合成骨化羊ADSCs來構(gòu)建組織工程化骨,測定其成骨潛能及細(xì)胞生物相容性,以驗證體外構(gòu)建組織工程骨的可行性,為今后臨床應(yīng)用建立理論及實驗基礎(chǔ)。方法:1.羊脂肪基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng):取無菌山羊腹部脂肪組織,0.1%I型膠原酶消化后以完全培養(yǎng)基原代培養(yǎng),傳至第3代。凍存?zhèn)溆谩?.ADSCs成骨方向誘導(dǎo)及分組:取第3代ADSCs,實驗組以含成骨誘導(dǎo)劑的完全培養(yǎng)液培養(yǎng),對照組僅用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。誘導(dǎo)14天后行堿性磷酸酶(ALP)染色,鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色,及骨鈣素表達(dá)以檢測成骨活性。3.納米化β-TCP/CS/PCL仿生融合器和鈦金屬融合器的制備及表面改性:納米化β-TCP/CS/PCL仿生融合器分為兩組,A組使用RGD多肽修飾,B組為未修飾組;鈦金屬融合器分為兩組,C組使用飛秒激光行表面納米級溝槽改性,D組為表面未改性組。4.成骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞接種于上述融合器復(fù)合培養(yǎng),分別于培養(yǎng)后的第1、7、14、21天行掃描電鏡觀察,第1、4、7、10、13、16、19、22天行MTT細(xì)胞增殖及ALP定量檢測。結(jié)果:1.原代培養(yǎng)24h后,ADSCs已沉降貼壁,形態(tài)不規(guī)則,多為圓型或多角型。72h后ADSCs已逐漸伸展為梭形,體積增大,部分細(xì)胞有粗大突起。培養(yǎng)3代后,細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,呈長梭狀,增生活躍。ADSCs成骨誘導(dǎo)后形態(tài)發(fā)生改變,由梭形變?yōu)槎嘟切�。成骨化鑒定ALP染色可見多數(shù)細(xì)胞核、胞質(zhì)內(nèi)染色呈陽性。茜素紅染色可見細(xì)胞之間有團(tuán)塊狀的鈣鹽沉積,呈深紅色或橘紅色結(jié)節(jié),多個礦化結(jié)節(jié)可融合。實驗組較對照組骨鈣素有明顯升高,差異有顯著性意義。2.四組融合器復(fù)合培養(yǎng)后掃描電鏡顯示,A、B組內(nèi)有大量細(xì)胞粘附,排列良好,完全伸展,A組相比B組細(xì)胞生長旺盛。C組表面細(xì)胞粘附數(shù)量少,D組較C組細(xì)胞脫落更為明顯。A、B組較C組細(xì)胞增殖活躍。3.A、B、C組前14天MTT結(jié)果及ALP酶活性均隨培養(yǎng)時間延續(xù)而遞增,后期細(xì)胞增殖速率緩慢。A、B兩組每個時間點OD值A(chǔ)LP酶活性均明顯高于C、D組,差異有顯著性意義(P0.05)。A組每個時間點OD值及ALP酶活性均明顯高于B組,差異有顯著性意義(P0.05)。C組每個時間點OD值及ALP酶活性均高于與D組,差異有顯著性意義(P0.05)。結(jié)論:1.利用膠原酶消化、貼壁分離羊ADSCs,成骨誘導(dǎo)后經(jīng)檢測證實其成骨潛能。羊ADSCs可用于構(gòu)建脊柱組織工程的種子細(xì)胞。2.成骨化ADSCs與納米化β-TCP/CS/PCL仿生融合器復(fù)合培養(yǎng)后,細(xì)胞在支架內(nèi)部生長良好,且分泌大量細(xì)胞外基質(zhì),表明體外成功構(gòu)建了組織工程化骨,該構(gòu)建的復(fù)合物有應(yīng)用于臨床作為椎間融合器的可行性。RGD有利于種子細(xì)胞的粘附,促進(jìn)細(xì)胞增殖。3.成骨化ADSCs與鈦合金椎間融合器復(fù)合培養(yǎng)后,細(xì)胞僅在在物理改性材料表面生長,且細(xì)胞外基質(zhì)分泌不明顯,非表面改性組細(xì)胞脫落較多,表明飛秒激光表面改性的納米級溝槽結(jié)構(gòu)有利于種子細(xì)胞的粘附、生長。4.接受RGD化學(xué)修飾的生物可降解性融合器存在多孔性及合適的細(xì)胞生長環(huán)境,而鈦合金融合器接種激光物理修飾細(xì)胞僅能停留于表面,無法往材料內(nèi)部縱深生長,生物可降解性融合器較金屬融合器具有顯著的生物學(xué)優(yōu)勢及應(yīng)用潛能。
【關(guān)鍵詞】：β-磷酸三鈣/殼聚糖/聚己內(nèi)酯 鈦合金 融合器 脂肪基質(zhì)細(xì)胞 RGD 激光 表面改性 組織工程化骨
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R318.08;R68
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語/符號說明11-12
• 前言12-15
• 研究現(xiàn)狀、成果12-13
• 研究目的、方法13-15
• 一、羊脂肪基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)及體外成骨誘導(dǎo)15-25
• 1.1 材料與方法15-18
• 1.1.1 試驗材料15-16
• 1.1.1.1 動物來源15
• 1.1.1.2 主要儀器設(shè)備15
• 1.1.1.3 主要實驗材料15-16
• 1.1.1.4 主要試劑及配制方法16
• 1.1.2 羊ADSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及體外成骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化16-17
• 1.1.2.1 羊腹部脂肪組織的提取16
• 1.1.2.2 ADSCs的純化及原代培養(yǎng)16-17
• 1.1.2.3 ADSCs的傳代培養(yǎng)及凍存17
• 1.1.2.4 多聚賴氨酸防脫片的制備17
• 1.1.2.5 ADSCs體外向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化17
• 1.1.3 成骨化羊ADSCs的鑒定17-18
• 1.1.3.1 堿性磷酸酶(ALP)染色17-18
• 1.1.3.2 茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色18
• 1.1.3.3 骨鈣素檢測18
• 1.1.4 統(tǒng)計學(xué)方法18
• 1.2 結(jié)果18-22
• 1.2.1 脂肪基質(zhì)細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察18-19
• 1.2.2 脂肪基質(zhì)細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后的形態(tài)學(xué)觀察19-20
• 1.2.3 成骨化羊ADSCs的堿性磷酸酶（ALP）染色鑒定20-21
• 1.2.4 成骨化羊ADSCs的茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色鑒定21
• 1.2.5 骨鈣素檢測結(jié)果21-22
• 1.3 討論22-24
• 1.3.1 種子細(xì)胞的選擇22
• 1.3.2 種子細(xì)胞向成骨化誘導(dǎo)22-23
• 1.3.3 成骨誘導(dǎo)后的鑒定23-24
• 1.4 小結(jié)24-25
• 二、成骨化羊ADSCs與納米化β-TCP/CS/PCL及鈦金屬融合器復(fù)合培養(yǎng)及檢測25-42
• 2.1 材料與方法25-28
• 2.1.1 主要儀器設(shè)備和實驗材料25-26
• 2.1.1.1 主要儀器設(shè)備25
• 2.1.1.2 主要實驗材料25-26
• 2.1.2 納米化β-TCP/CS/PCL仿生融合器的制備26
• 2.1.2.1 仿生融合器尺寸的確定26
• 2.1.2.2 仿生融合器的制備及消毒處理26
• 2.1.3 納米化β-TCP/CS/PCL仿生融合器性能檢測26
• 2.1.3.1 孔隙率測定26
• 2.1.3.2 力學(xué)性能檢測26
• 2.1.3.3 孔徑測定26
• 2.1.4 鈦合金融合器的制備及飛秒激光表面改性26-27
• 2.1.5 β-TCP/CS/PCL融合器的RGD修飾及成骨化ADSCs的接種27
• 2.1.6 鈦合金融合器復(fù)合成骨化ADSCs培養(yǎng)27-28
• 2.1.7 四組融合器復(fù)合細(xì)胞培養(yǎng)后掃描電鏡(SEM)觀察28
• 2.1.8 MTT檢測細(xì)胞增殖活性及堿性磷酸酶活性定量檢測28
• 2.2 結(jié)果28-36
• 2.2.1 納米化β-TCP/CS/PCL仿生融合器的大體形貌和微觀形貌28-29
• 2.2.2 納米化β-TCP/CS/PCL仿生融合器的理化性征檢測29-31
• 2.2.3 激光改性前后鈦合金融合器的大體形貌和微觀形貌31
• 2.2.4 四組融合器復(fù)合細(xì)胞培養(yǎng)后掃描電鏡(SEM)觀察31-33
• 2.2.5 MTT檢測細(xì)胞增殖活性結(jié)果33-35
• 2.2.6 堿性磷酸酶活性定量檢測35-36
• 2.3 討論36-40
• 2.3.1 飛秒激光技術(shù)的應(yīng)用36-37
• 2.3.2 RGD多肽的應(yīng)用37
• 2.3.3 支架材料的選擇和制備37-38
• 2.3.4 細(xì)胞活性的檢測38-39
• 2.3.5 種植體材料的復(fù)合39
• 2.3.6 組織工程支架的評價指標(biāo)39-40
• 2.4 小結(jié)40-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-49
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明49-50
• 綜述50-62
• 綜述參考文獻(xiàn)57-62
• 致謝62

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張利,李玉寶,楊愛萍,左奕,呂國玉,魏杰;骨組織工程用納米羥基磷灰石/殼聚糖多孔支架材料的制備及性能表征[J];功能材料;2005年02期

2 郭洪剛;馬信龍;;骨代謝相關(guān)基因單核甘酸多態(tài)性在脊柱后縱韌帶骨化發(fā)生中的作用[J];中國脊柱脊髓雜志;2011年10期

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本文編號：886477