本文關鍵詞：脂肪干細胞向骨、軟骨細胞誘導分化及新型椎間盤支架構建的實驗研究

  更多相關文章： 組織工程 骨軟骨 種子細胞 椎間盤 支架 纖維環(huán)

【摘要】：目的： 1.探討兔脂肪干細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)向骨、軟骨細胞定向分化的能力,為構建組織工程骨軟骨提供理想的種子細胞；比較軟骨細胞共培養(yǎng)法和誘導液培養(yǎng)法誘導ADSCs向軟骨細胞分化的效果,為構建組織工程骨軟骨提供更加有效的誘導方法。 2.用脫細胞脫鈣骨基質(cell-free deminerized bone matrix, CFDBM)和脫細胞髓核基質構建新型一體化纖維環(huán)-髓核雙相支架,并進行理化檢測,探討其作為組織工程椎間盤支架的可行性；探討不同脫細胞方法對豬尾椎間盤纖維環(huán)組織結構及生物力學特性的影響,為構建組織工程纖維環(huán)提供實驗依據(jù)。 方法： 1.分離、培養(yǎng)兔ADSCs,將第3代ADSCs分別用成骨誘導液及軟骨誘導液培養(yǎng),顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化,14天后通過組織學觀察和實時熒光定量PCR檢測其分別向骨、軟骨細胞定向分化的能力。 2.分別用與軟骨細胞共培養(yǎng)法和誘導液培養(yǎng)法誘導ADSCs向軟骨細胞分化并鑒定,顯微鏡觀察ADSCs的形態(tài)變化,14天后行甲苯胺藍染色、Ⅱ型膠原免疫組化,實時熒光定量PCR測定軟骨細胞相關基因的表達情況,比較兩種方法的誘導效果。 3.取豬股骨近端松質骨,塑形成外徑10mm、內徑5mm、厚3mm的骨環(huán),經脫脂、脫鈣、脫細胞處理制備成纖維環(huán)相支架部分；取豬尾髓核組織,脫細胞后粉碎離心,制備脫細胞髓核基質,注入纖維環(huán)相支架中央,冷凍干燥,交聯(lián),作為髓核相支架部分。通過大體觀察、HE染色、掃描電鏡觀察纖維環(huán)-髓核雙相支架的結構；測定支架的孔隙率、吸水率、壓縮彈性模量；MTT法檢測支架浸提液對ADSCs增殖的影響；Live/Dead染色觀察細胞在支架上的活性。 4.取新鮮豬尾纖維環(huán),分別用三種脫細胞方法(分別含有Triton X-100、SDS、胰蛋白酶)對其進行脫細胞處理。大體觀察脫細胞處理后的纖維環(huán),采用組織學與掃描電鏡觀察脫細胞情況及超微結構的變化；測定脫細胞纖維環(huán)的膠原含量、GAG含量及力學參數(shù)。 結果： 1. ADSCs體外培養(yǎng)呈長梭形,增殖迅速,穩(wěn)定性好。經過誘導逐漸變?yōu)槌晒羌败浌菢蛹毎?14天后成骨誘導的ADSCs堿性磷酸酶染色、茜素紅染色和von Kossa染色均為陽性；成軟骨誘導的ADSCs甲苯胺藍染色、Ⅱ型膠原免疫組化陽性,Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、SOX9的基因轉錄水平明顯增高。 2.兩種方法培養(yǎng)的ADSCs逐漸變?yōu)檐浌菢蛹毎?甲苯胺藍、Ⅱ型膠原免疫組化均為陽性,其中誘導液培養(yǎng)法細胞染色更深,且Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、SOX9的基因轉錄水平明顯高于軟骨細胞共培養(yǎng)法。 3.大體觀察支架呈乳白色；HE染色顯示無細胞殘留；掃描電鏡可見外層纖維環(huán)相支架孔徑大小均勻一致,孔隙相互貫通,中央脫細胞髓核基質微絲連接成網,交界處結合緊密。纖維環(huán)相支架孔徑為(343.00±88.25)μm,一體化支架孔隙率為82.98%±7.02%、吸水率為621.53%±53.31%,壓縮彈性模量為(89.07±8.73)kPa。經MTT測定支架浸提液對細胞的增殖無影響；Live/Dead染色可見細胞在支架上生長良好。 4.組織學及掃描電鏡可見Triton X-100、SDS、胰蛋白酶三組均無細胞殘留；Triton X-100組纖維環(huán)超微結構未見破壞,胰蛋白酶組輕度破壞,SDS組明顯破壞。三組纖維環(huán)膠原含量與天然纖維環(huán)相比無統(tǒng)計學差異；但GAG含量均低于天然纖維環(huán)(P0.05)。Triton X-100、胰蛋白酶兩組的力學性能與天然纖維環(huán)相比無統(tǒng)計學差異,SDS組力學參數(shù)均低于天然纖維環(huán)(P0.05)。 結論： 1.在特定條件下ADSCs可以向成骨細胞及軟骨細胞定向分化；軟骨細胞共培養(yǎng)法和誘導液培養(yǎng)法均可誘導ADSCs向軟骨細胞定向分化,誘導液培養(yǎng)法誘導效果更好。 2.用CFDBM和脫細胞髓核基質制備的一體化纖維環(huán)-髓核雙相支架具有合適的孔徑和孔隙率,無毒,力學性能與天然椎間盤接近,是構建組織工程椎間盤的理想支架載體。 3. Triton X-100組處理后的豬尾椎間盤纖維環(huán)無細胞殘留,結構無破壞,基質成分及力學性能保存良好,適合作為構建組織工程纖維環(huán)的支架材料。
【關鍵詞】：組織工程 骨軟骨 種子細胞 椎間盤 支架 纖維環(huán)
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R318.08
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語/符號說明11-12
• 前言12-15
• 研究現(xiàn)狀、成果12-14
• 研究目的、方法14-15
• 一、脂肪干細胞向骨、軟骨細胞誘導分化的實驗研究15-30
• 1.1 對象和方法15-23
• 1.1.1 實驗材料及試劑15
• 1.1.2 實驗試劑配制15-17
• 1.1.3 實驗儀器17-18
• 1.1.4 實驗方法18-23
• 1.1.5 統(tǒng)計學分析23
• 1.2 結果23-24
• 1.2.1 ADSCs的形態(tài)學觀察23
• 1.2.2 ADSCs向成骨細胞誘導時的形態(tài)變化23
• 1.2.3 成骨誘導鑒定23
• 1.2.4 ADSCs向軟骨細胞誘導時的形態(tài)變化23
• 1.2.5 ADSCs向軟骨細胞誘導時的增殖速度23-24
• 1.2.6 成軟骨誘導鑒定24
• 1.3 討論24-25
• 1.3.1 酶消化法分離提取ADSCs24
• 1.3.2 成軟骨誘導因子24-25
• 1.4 小結25-26
• 附圖26-30
• 二、不同方法誘導脂肪干細胞向軟骨細胞分化的對比研究30-37
• 2.1 對象和方法30-32
• 2.1.1 實驗材料及試劑30
• 2.1.2 實驗試劑配制30
• 2.1.3 實驗儀器30
• 2.1.4 實驗方法30-31
• 2.1.5 統(tǒng)計學分析31-32
• 2.2 結果32
• 2.2.1 ADSCs的形態(tài)學觀察32
• 2.2.2 軟骨細胞的形態(tài)學觀察32
• 2.2.3 軟骨細胞的鑒定32
• 2.2.4 不同方法成軟骨誘導時的形態(tài)變化32
• 2.2.5 不同方法成軟骨誘導結果對比32
• 2.3 討論32-33
• 2.3.1 誘導液培養(yǎng)法32-33
• 2.3.2 軟骨細胞共培養(yǎng)法33
• 2.3.3 實驗結果分析33
• 2.4 小結33-34
• 附圖34-37
• 三、新型一體化纖維環(huán)-髓核雙相支架的制備與評估37-49
• 3.1 對象和方法37-42
• 3.1.1 實驗材料及試劑37
• 3.1.2 實驗試劑配制37-38
• 3.1.3 實驗儀器38
• 3.1.4 實驗方法38-42
• 3.1.5 統(tǒng)計學分析42
• 3.2 結果42-43
• 3.2.1 支架的大體觀察42
• 3.2.2 支架組織學觀察42
• 3.2.3 支架的掃描電鏡觀察42
• 3.2.4 支架的吸水率、孔隙率以及力學性能測定42-43
• 3.2.5 支架材料生物相容性43
• 3.3 討論43-44
• 3.3.1 椎間盤支架材料43
• 3.3.2 脫細胞脫鈣骨基質43-44
• 3.3.3 脫細胞髓核基質44
• 3.3.4 支架的理化特性及生物相容性44
• 3.4 小結44-45
• 附圖45-49
• 四、不同脫細胞方法對豬尾纖維環(huán)力學性能及組織結構的影響49-62
• 4.1 對象和方法49-53
• 4.1.1 實驗材料及試劑49
• 4.1.2 實驗試劑配制49-50
• 4.1.3 實驗儀器50
• 4.1.4 實驗方法50-53
• 4.1.5 統(tǒng)計學分析53
• 4.2 結果53-55
• 4.2.1 脫細胞纖維環(huán)基質的大體觀察53
• 4.2.2 脫細胞纖維環(huán)基質的組織學觀察53-54
• 4.2.3 脫細胞纖維環(huán)基質的電鏡觀察54
• 4.2.4 脫細胞纖維環(huán)基質的生化成分含量54
• 4.2.5 脫細胞纖維環(huán)基質的力學性能測定54-55
• 4.3 討論55
• 4.3.1 脫細胞效果及結構保留情況55
• 4.3.2 膠原及GAG含量55
• 4.3.3 力學性能55
• 4.4 小結55-56
• 附圖56-62
• 結論62-63
• 參考文獻63-71
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明71-73
• 綜述73-79
• 綜述參考文獻77-79
• 致謝79-80

【參考文獻】

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本文編號：876486