本文關(guān)鍵詞：直接快速液氮凍存人羊膜的初步研究

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【摘要】：目的探索快速液氮冷凍保存人羊膜保存方法的抗凍劑配方,并與其他常用保存方法比較,為建立深低溫保存高活性的人羊膜庫(kù)提供依據(jù)。 本研究分為兩部分： 實(shí)驗(yàn)一、快速液氮保存人羊膜抗凍劑的初步篩選 實(shí)驗(yàn)二、液氮保存法與其他保存方法的比較研究 方法實(shí)驗(yàn)一、選取12只健康剖宮產(chǎn)婦胎盤,剝離其羊膜,根據(jù)預(yù)處理抗凍劑的不同將羊膜隨機(jī)分6組保存：A組(DMEM對(duì)照組)、B組(DMEM/甘油組)、C組(DMEM/DMSO組)、D組(DMEM/海藻糖組)E組(DMEM/甘油/DMSO/組)、F組(DMEM/甘油/DMSO/每藻糖組)。A組經(jīng)不含抗凍劑的DMEM處理后,直接將其快速放入液氮中凍存,簡(jiǎn)稱快凍△。其余5組分別經(jīng)不同抗凍劑預(yù)處理后快凍。保存第1、3、6個(gè)月后,取羊膜行HE染色觀察羊膜細(xì)胞形態(tài)變化,臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算羊膜上皮細(xì)胞死亡率,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞因子(EFG)表達(dá),各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別對(duì)照組(A組)及新鮮羊膜(G組)對(duì)比,以篩選出快凍保存羊膜的最優(yōu)抗凍劑配方。 實(shí)驗(yàn)二、選取12只健康剖宮產(chǎn)婦胎盤,剝離其羊膜,根據(jù)保存方法的不同將羊膜隨機(jī)分4組：A組(液氮保存組)、B組(甘油4℃保存組)、C組(DMEM/甘油-80℃保存組)、D組(冷凍干燥保存組)A組采用實(shí)驗(yàn)一篩選出的抗凍劑配方處理后放入液氮中快凍。其余3組按各自保存方法處理。保存后第1、3、6個(gè)月取羊膜行HE染色、臺(tái)盼藍(lán)染色、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)羊膜活性,各組觀察結(jié)果分別新鮮羊膜(E組)對(duì)比。 結(jié)果實(shí)驗(yàn)一、①新鮮羊膜由單層立方上皮、基底膜和無血管基質(zhì)組成。各組保存羊膜結(jié)構(gòu)均遭到不同程度破壞。其中,F組羊膜上皮組織改變最小,保存6個(gè)月后羊膜細(xì)胞形態(tài)完整,與新鮮羊膜接近；A組羊膜結(jié)構(gòu)破壞最明顯,保存6個(gè)月后上皮細(xì)胞大部分破裂、基底膜溶解消失,羊膜連續(xù)性與完整性均遭到破壞；其余各組保存1個(gè)月后羊膜結(jié)構(gòu)尚可,3個(gè)月后羊膜細(xì)胞形態(tài)改變加劇,6個(gè)月后羊膜分別出現(xiàn)細(xì)胞排列松散、脫失、胞核固縮、細(xì)胞空泡樣變等。 ②各組羊膜細(xì)胞死亡率隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)而呈遞增趨勢(shì)。F組細(xì)胞存活情況最好,保存6個(gè)月后羊膜細(xì)胞死亡率仍低于20%；A組保存效果最差,3個(gè)月細(xì)胞已半數(shù)死亡(59.75±11.12%),6個(gè)月后羊膜細(xì)胞大部分死亡(81.50±4.50%)；B組保存效果也不理想,在各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞死亡率均超過20%；C、D、E3組保存1個(gè)月后細(xì)胞存活良好,但3個(gè)月的保存效果欠佳(死亡率20%)。 ③羊膜EGF主要分布于上皮層,各組保存1、3、6個(gè)月EGF表達(dá)與新鮮羊膜(G組)相比,A、B、C、D、E5組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),F組與新鮮羊膜無明顯差別(P0.05)。 實(shí)驗(yàn)二、①A組保存羊膜上皮細(xì)胞形態(tài)完整緊湊,與新鮮羊膜差別不大；B組保存1個(gè)月羊膜結(jié)構(gòu)完整,但3個(gè)月后部分細(xì)胞出現(xiàn)破裂、脫失,基底層變薄,6個(gè)月后多數(shù)細(xì)胞破裂、呈絨毛樣外觀；C組保存1、3個(gè)月可見羊膜細(xì)胞排列整齊,基底膜完整而連續(xù),6個(gè)月后上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變,少部分細(xì)胞溶解；D組保存羊膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化不明顯,6個(gè)月可見部分細(xì)胞胞核固縮、上移、空泡樣變,羊膜各層結(jié)構(gòu)較清晰。 ②A組保存效果較好,1、3、6月羊膜細(xì)胞死亡率均低于20%；C組保存羊膜細(xì)胞較差,在各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞死亡率均超過20%；B組和D組保存1個(gè)月后羊膜細(xì)胞已全部死亡。 ③與新鮮羊膜(E組)EGF表達(dá)相比,A組保存1、3、6個(gè)月均無明顯差別(P0.05),B、C2組各時(shí)間點(diǎn)均有顯著差別(P0.05),D組保存1個(gè)月無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),3、6個(gè)月差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論： 1、對(duì)于直接快速液氮凍存人羊膜,DMEM/甘油/DMSO/海藻糖復(fù)合抗凍劑的效果最好,羊膜可維持較高的活性； 2、與其他保存方法相比,直接快速液氮凍存法在維持羊膜細(xì)胞的存活和細(xì)胞因子的表達(dá)方面均有一定的優(yōu)勢(shì)。 3、此法操作簡(jiǎn)單,無需程序降溫儀等特殊設(shè)備,適合于各級(jí)醫(yī)院大批量人羊膜的儲(chǔ)存。
【關(guān)鍵詞】：人羊膜 抗凍劑 液氮 深低溫保存 快凍
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R318.52
【目錄】：

• 主要中英文縮略詞對(duì)照表4-5
• 技術(shù)路線圖5-6
• 摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-13
• 參考文獻(xiàn)13-18
• 材料與方法18-24
• 結(jié)果24-32
• 實(shí)驗(yàn)一24-28
• 實(shí)驗(yàn)二28-32
• 討論32-42
• 實(shí)驗(yàn)一32-38
• 參考文獻(xiàn)35-38
• 實(shí)驗(yàn)二38-42
• 參考文獻(xiàn)41-42
• 綜述42-72
• 參考文獻(xiàn)55-72
• 附圖72-78
• 致謝78-79
• 讀研期間發(fā)表論文79

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前9條

1 李遠(yuǎn);楊波;關(guān)方霞;宋來君;杜英;趙中甫;�？肆�;王卿峰;胡祥;;不同凍存液對(duì)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞-80℃凍存與復(fù)蘇效果的影響[J];鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年02期

2 邵同先,張?zhí)K亞;復(fù)方甘油抗凍劑對(duì)低溫凍存精子的保護(hù)作用[J];河南職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2004年03期

3 華萍;華東;趙集帥;任越;萬(wàn)麗丹;呂虎;;不同保存方法對(duì)羊膜生物學(xué)性能影響的比較研究[J];南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2010年11期

4 程晨晨;常青;高洪波;徐平;;海藻糖保護(hù)同種帶瓣大動(dòng)脈的最適濃度[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2011年16期

5 劉紹輝 ,王傳富,趙桂秋,孟凡會(huì);簡(jiǎn)化一步深低溫保存法保存羊膜的實(shí)驗(yàn)研究[J];眼科新進(jìn)展;2002年05期

6 魯靜;趙敏;張琪;胡柯;秦應(yīng)祥;;四種方法保存羊膜的組織形態(tài)學(xué)研究[J];眼科新進(jìn)展;2007年07期

7 蔡宏,賈曉明,吳志谷,姚詠明,楊毅,李紹然,陸江陽(yáng);海藻糖對(duì)低溫保存皮膚的作用[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2005年02期

8 劉紹輝,王傳富,趙桂秋,孟凡會(huì);羊膜保存方法及其對(duì)羊膜活性影響的研究[J];中國(guó)實(shí)用眼科雜志;2002年11期

9 高明宏;張勁松;藍(lán)平;;超低溫(-196℃)保存角膜緣上皮細(xì)胞的生物活性研究[J];中國(guó)實(shí)用眼科雜志;2006年06期

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本文編號(hào)：805368